李靜雯，厚毅清，陳 軍，朱天地

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，蘭州 730070)

維持胞內(nèi)離子和pH穩(wěn)態(tài)對細(xì)胞的活動和功能至關(guān)重要[1-2]。已有研究表明，植物Na+、 K+/H+反向轉(zhuǎn)運體(NHX)對維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡和調(diào)節(jié)pH平衡具有重要作用，并在各種細(xì)胞過程中扮演重要角色，包括逆境響應(yīng)、膜微囊運輸、蛋白存貯、細(xì)胞生長、滲透調(diào)節(jié)、Na+和 K+離子運輸及生長與發(fā)育等生理生化過程[3-7]。NHX是一類跨膜反向轉(zhuǎn)運蛋白，屬于一價陽離子/H+反向轉(zhuǎn)運體(cation/proton antiporter，CPA)基因家族中的CPA1亞家族，生化活性是將Na+或K+與質(zhì)子(H+)進行跨膜反向轉(zhuǎn)運，在酵母、細(xì)菌、植物和動物等生物體內(nèi)廣泛存在[8-9]。

植物NHX基因家族分為三類，即質(zhì)膜NHXs，液胞NHXs和內(nèi)膜NHXs。模式植物擬南芥中NHX基因家族包含8個成員，其中質(zhì)膜NHXs(AtNHX7/SOS1、AtNHX8)、液胞NHXs(AtNHX1-4)研究的相對較早，且對AtNHX7/SOS1的調(diào)節(jié)機制研究最為清楚[10-15]。擬南芥內(nèi)膜AtNHX5和AtNHX6基因編碼的反向轉(zhuǎn)運體定位在高爾基、反面高爾基體管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(TGN)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和液胞前體(PVC)[4,16-17]。有研究表明，AtNHX5既能抑制酵母突變體nhx1對潮霉素和鹽脅迫的敏感性，又能增加對Li+的耐受性，在擬南芥中內(nèi)膜NHXs調(diào)節(jié)胞內(nèi)和內(nèi)膜系統(tǒng)內(nèi)的pH及離子平衡[16]，影響囊泡運輸和蛋白存貯[18-20]，并通過調(diào)節(jié)生長素影響植株生長和發(fā)育[3-4]，這些結(jié)果說明，與擬南芥質(zhì)膜和液胞NHXs而言，內(nèi)膜NHXs具有獨立功能，是NHX家族的重要組成部分。目前對擬南芥AtNHX5的亞細(xì)胞定位、功能已進行初步研究，但對其啟動子及組織表達模式的研究較少，基于此，本研究克隆AtNHX5基因啟動子并進行序列分析，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，并利用GUS染色檢測研究AtNHX5基因在植株不同組織中的表達特性。 以期探明AtNHX5在擬南芥幼苗和成株各組織內(nèi)的表達強弱情況，為進一步探尋AtNHX5在離子轉(zhuǎn)運和pH調(diào)節(jié)中的作用和調(diào)控機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及生長條件

野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)為Col-0 。所用植物材料生長室溫21 ℃，光強100 μmol/(m2·s)，光周期為16 h/8 h(光照/黑暗)，相對濕度50 %± 10 %。無菌材料培養(yǎng)，先用φ=20 %的次氯酸鈉將種子表面消毒13 min，再用無菌蒸餾水漂洗6次，然后點種在含有10 g/L瓊脂，pH 5.8的MS固體培養(yǎng)基中，置于4 ℃冷藏箱中暗處春化3 d后轉(zhuǎn)入溫室萌發(fā)生長。需完成整個生長周期的材料，在萌發(fā)生長7 d后移入營養(yǎng)土內(nèi)，置于溫室內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 菌株、載體

所用大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌GV3101，均由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所遺傳工程實驗室保存提供。所用植物表達載體為pCAMBIA1391。

1.3 引 物

試驗所用各引物序列見表1，引物序列利用軟件Primer Premier 5設(shè)計。

表1 試驗所用引物序列Table 1 Primers used in experiment

注：引物PRNHX5-F和PRNH5-R下劃線序列分別為SalⅠ和EcoRⅠ酶切位點。

Note:Underline sequences of PRNHX5-F and PRNH5-R wereSalⅠ andEcoRⅠrestricyion sites,respectively.

1.4 DNA提取及 AtNHX5基因啟動子克隆

以野生型擬南芥Col-0為材料，用生工植物基因組提取試劑盒從中提取擬南芥基因組DNA。根據(jù)TAIR網(wǎng)站公布的擬南芥基因組數(shù)據(jù)，選取AtNHX5基因開放閱讀框(ORF)上游1 807 bp啟動子序列，運用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5設(shè)計特異性引物PRNHX5-F和PRNHX5-R，并根據(jù)表達載體和啟動子序列內(nèi)酶切位點在引物5′端分別添加SalⅠ和EcoRⅠ酶切位點及保護堿基，引物序列由華大基因公司合成。以獲得的擬南芥基因組DNA為模板，用高保真酶進行PCR擴增，擴增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠回收并純化。

1.5 AtNHX5基因啟動子序列分析

利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線軟件對AtNHX5基因轉(zhuǎn)錄起始位點前1 807 bp的啟動子序列進行分析，預(yù)測順式作用元件。

1.6 載體構(gòu)建及植株轉(zhuǎn)化、篩選

用NEB的SalⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶分別雙酶切表達載體pCAMBIA1391質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物，并回收目的片段。利用promage公司T4連接酶將回收的PCR目的產(chǎn)物構(gòu)建到表達載體pCAMBIA1391上并轉(zhuǎn)入大腸桿菌擴增，獲得GUS(β-半乳糖苷酶)表達載體pCAMBIA1391-proNHX5-GUS。經(jīng)PCR擴增、酶切及測序鑒定正確的表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。農(nóng)桿菌在YEP固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，YEP培養(yǎng)基成分為： 5 g/L牛肉膏，1 g/L酵母提取物，5 g/L蛋白胨，5 g/L蔗糖，4 g/L MgSO4·7H2O，15 g/L瓊脂，pH 7.4。通過PCR鑒定獲得轉(zhuǎn)入成功的農(nóng)桿菌菌株，并通過花序浸染法轉(zhuǎn)染到野生型擬南芥中[21]。轉(zhuǎn)基因材料在含有50 mg/L的潮霉素(Hygromycin B)的MS培養(yǎng)板上進行篩選，選用啟動子測序所用正向引物C-PRNHX5-F2和GUS基因內(nèi)特異反向引物GUS-R對抗性篩選獲得株系進行PCR鑒定，以便確定所選株系中存在融合目的基因序列。獲得的第3代轉(zhuǎn)基因植株的3個獨立的純合體株系用于GUS染色分析。

1.7 GUS染色分析

選用生長在MS培養(yǎng)基上的整株幼苗和盆栽成熟植株的不同組織進行GUS組織化學(xué)檢測分析。選取的材料浸透在染色液(100 mmol/L 磷酸緩沖液， pH 7.0，1.9 mmol/L 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸， 0.5 mmol/L 鐵氰化鉀， 0.5 mmol/L亞鐵氰化鉀，φ=0.1% Triton X-100，10 mmol/L EDTA 和φ=20 %甲醇)中，于37 ℃過夜染色后去掉染色液，加入φ=70 %乙醇用于脫去葉綠素。去凈葉綠素的材料在體視顯微鏡下觀察照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥 AtNHX5基因啟動子的克隆及順式作用元件分析

根據(jù)已知擬南芥基因組序列信息，設(shè)計帶有特異酶切位點和保護堿基的引物，正向擴增引物PRNHX5-F含有SalⅠ酶切位點，反向擴增引物PRNHX5-R含有EcoRⅠ酶切位點，以擬南芥Col-0基因組DNA為模板，采用高保真酶進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物大小為1 825 bp。將擴增產(chǎn)物進行核酸電泳檢測，結(jié)果表明擴增條帶符合預(yù)期大小(圖1)。

對proNHX5分析發(fā)現(xiàn)，序列中除了包含啟動子典型的核心元件TATA-box和CAAT-box等外，還包含AE-box、Box 4、GA-motif、GT1-motif、TCT-motif光響應(yīng)元件；ABA響應(yīng)元件ABRE；茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTGA-motif和TGACG-motif；生長素響應(yīng)元件TGA-element；分生組織表達調(diào)控元件CAT-box；厭氧誘導(dǎo)的必須調(diào)控元件ARE和防御與應(yīng)激相關(guān)元件TC-rich repeats(表2)。

M.DNA marker D2000; proNHX5.AtNHX5啟動子序列AtNHX5promoter sequence

圖1AtNHX5基因啟動子的克隆
Fig.1 Clone ofAtNHX5gene promoter

表2 AtNHX5啟動子區(qū)域順式作用元件預(yù)測Table 2 Prediction of cis-acting elements in promoter of AtNHX5

2.2 pCAMBIA1391-proNHX5-GUS啟動子表達載體的構(gòu)建及鑒定

如圖2-A，為了研究AtNHX5基因啟動子的活性和組織表達模式，將啟動子擴增產(chǎn)物proNHX5和植物表達載體pCAMBIA1391分別用NEB的SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切后連接，經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒酶切驗證獲得正確的重組質(zhì)粒pCAMBIA1391-proNHX5-GUS。DH5α菌落PCR擴增產(chǎn)物大小為1 825 bp，與預(yù)期結(jié)果相一致(圖2-B)。由于在構(gòu)建中連接部位為SalⅠ和EcoRⅠ酶切位點，重組成功的質(zhì)粒單酶切后電泳應(yīng)有一條大小為12 454 bp的目的條帶，而雙酶切后電泳應(yīng)有一條大小分別為10 641 bp的線性質(zhì)粒條帶和一條1 813 bp與proNHX5幾乎一致的序列條帶，酶切試驗結(jié)果符合預(yù)期，說明AtNHX5啟動子成功克隆到pCAMBIA1391載體中(圖2-C)。通過進一步測序驗證，證實測序序列結(jié)果與數(shù)據(jù)庫序列一致。

A：pCAMBIA1391-proNHX5-GUS表達載體構(gòu)建示意圖 Map of construction of pCAMBIA1391-proNHX5-GUS expression vector；B：pCAMBIA1391-proNHX5-GUS表達載體的PCR分析 PCR analysis of pCAMBIA1391-proNHX5-GUS vector；M.DNA marker D2000；+.proNHX5啟動子序列AtNHX5promoter sequence; 1～5.載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌液PCR產(chǎn)物 PCR product of fusion expression vector transformed intoE.coliDH5α；-.陰性對照 Negative control；C：pCAMBIA1391-proNHX5-GUS表達載體酶切鑒定 Identification of promoter analysis vector pCAMBIA1391-proNHX5-GUS by digestion；M.DNA marker D15000；S1.EcoRI單酶切 Single-digestion products byEcoRI；S2.SalI和EcoRI雙酶切 Double-digestion products byEcoRI andSalⅠ；+.proNHX5啟動子序列AtNHX5promoter sequence

圖2AtNHX5啟動子載體構(gòu)建
Fig.2 Vector construction ofAtNHX5promoter

2.3 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的獲得

將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，在含有Rif和Kan抗生素的YEP固體培養(yǎng)基上篩選，挑取單菌落，通過菌落PCR篩選，能夠擴增出與proNHX5啟動子克隆序列大小一致的條帶為成功導(dǎo)入表達載體的陽性菌株 (圖3)。獲得的陽性農(nóng)桿菌通過花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥Col-0，將得到的T0代種子經(jīng)消毒后播種于含有潮霉素的MS培養(yǎng)基中進行篩選，具有抗性的植株經(jīng)PCR檢測為陽性的單株收獲種子并加代，獲得T3代純合轉(zhuǎn)基因株系(圖4)。

M.DNA marker D2000；+.陽性對照 Positive control；1～8.載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌液PCR產(chǎn)物 PCR product of expression vector transformed intoE.coliDH5α; -.陰性對照 Negative control

圖3 農(nóng)桿菌菌液PCR鑒定
Fig.3 PCR detection of agrobacterium tumefaciens

M.DNA marker D2000；+.陽性質(zhì)粒對照 Positive control; 1～7.轉(zhuǎn)基因植株 Transgenic fusionArabidopsis; -.野生型對照 Wild type

圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的PCR
Fig.4 PCR analysis of transgenicArabidopsis

2.4 AtNHX5啟動子在擬南芥中的表達分析

為檢測基因的組織表達模式，分別選取培養(yǎng)基上萌發(fā)生長1 d、2 d、3 d、6 d、9 d、12 d的整株轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗和盆栽生長45 d植株的莖、葉、花和果莢進行GUS組織化學(xué)染色。試驗證明，3個獨立的純合轉(zhuǎn)基因株系有著相似的表達模式。結(jié)果顯示，由AtNHX5基因的啟動子控制的GUS表達活性，在植株整個發(fā)育過程中一直都有表達(圖5和圖6)。萌發(fā)1 d到3 d的幼苗中，GUS活性在子葉和下胚軸中廣泛表達，而種皮和胚根中未見表達(圖5-A-圖5-C)。隨著幼苗生長，子葉和莖中GUS仍廣泛表達，且子葉和莖中微管系統(tǒng)的GUS表達最為顯著，真葉中僅局部檢測到GUS表達，生長6 d、9 d和12 d 的轉(zhuǎn)基因植株根中也只有局部區(qū)域檢測到微弱GUS表達(圖5-D-圖5-F)。成熟植株中，莖中有明顯的GUS表達(圖6-A和圖6-D)。在成熟葉片中，有的檢測不到GUS的表達，有的僅葉尖局部檢測到GUS表達(圖6-B)。在花中，柱頭、花柱、花柄和花瓣的微管中檢測到GUS明顯表達，花瓣部分區(qū)域微弱表達，而在花序頂端花苞未見GUS表達(圖6-D)。在未成熟果莢中，GUS主要表達在果柄、果莢頂端和基部，早期幼嫩果莢表皮也有弱的表達，隨著果莢發(fā)育，果莢表皮將檢測不到GUS表達(圖6-C和圖6-D)。接近成熟果莢中，只有果柄有很微弱的GUS表達，果莢頂端和基部未見GUS表達(圖6-C)。

A～F.生長1 d、2 d、3 d、6 d、9 d、12 d的轉(zhuǎn)基因植株 Arabidopsis seedlings of 1 d 2 d,3 d,6 d,9 d,12 d

A.莖 Stem；B.葉 Leaf；C.果莢 Silique；D.花序與果莢 Inflorescences and sulique；E.花 Flower

3 討 論

植物基因表達調(diào)控過程主要有DNA水平調(diào)控、染色體水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯調(diào)控和翻譯后調(diào)控，在這些調(diào)控方式中，轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是最為主要的。啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因上游的DNA序列，不僅決定基因轉(zhuǎn)錄方向和RNA聚合酶類型，還是轉(zhuǎn)錄水平上基因表達調(diào)控的中心[22]。在啟動子區(qū)域，有很多在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控過程中具有重要作用的順式作用元件，參與調(diào)控下游基因表達，從而調(diào)節(jié)生長發(fā)育和抵抗外界環(huán)境脅迫[23]。在啟動子的核心啟動子區(qū)域通常包含TATA-box和CAAT-box元件，也是啟動子的特征序列。通過對AtNHX5基因開放閱讀框上游序列分析，發(fā)現(xiàn)該序列中具有多個TATA-box和CAAT-box核心啟動子元件，說明其具有典型啟動子特征。

啟動子除了具有典型的核心啟動子元件外，還有眾多與基因功能相關(guān)的調(diào)節(jié)元件或結(jié)合位點。因此，在相近基因的啟動子序列中，應(yīng)該存在很多一致的順式作用元件。李紅婷等[24]克隆分析醋栗番茄NHX4基因啟動子發(fā)現(xiàn)，在啟動子序列內(nèi)含有多個與激素、逆境誘導(dǎo)相關(guān)元件和光反應(yīng)相關(guān)元件。鄒蘭等[25]克隆的鹽生草HgNHX1基因啟動子中包含多個與非生物脅迫、植物激素誘導(dǎo)及光應(yīng)答元件。本研究也得到類似結(jié)果，在AtNHX5基因啟動子序列內(nèi)發(fā)現(xiàn)多個光響應(yīng)元件和激素、逆境誘導(dǎo)相關(guān)元件，另外，還發(fā)現(xiàn)分生組織表達調(diào)控元件(表2)。這些結(jié)果預(yù)示著AtNHX5基因的表達可能受到逆境脅迫、激素及光等信號的調(diào)控。有研究表明，AtNHX5作為重要的內(nèi)膜Na+，K+/H+反向轉(zhuǎn)運體，在應(yīng)對鹽脅迫、水分脅迫和鉀營養(yǎng)代謝中具有重要作用[16,26-28]，同時，最新研究顯示擬南芥內(nèi)膜反向轉(zhuǎn)運體參與生長素介導(dǎo)的生長與發(fā)育[3-4]，這都與啟動子分析結(jié)果中的調(diào)節(jié)元件功能相一致，也預(yù)示著AtNHX5很可能在光響應(yīng)、分生組織表達和茉莉酸調(diào)控中的作用還未被發(fā)現(xiàn)，值得進一步研究。

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥，對獲得的純合體株系進行GUS組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)proNHX5正確啟動GUS基因表達，說明克隆的proNHX5序列具有啟動子活性。Bassil等[17]用熒光實時定量PCR(RT-qPCR)分析表明，AtNHX5和AtNHX6基因在擬南芥生長發(fā)育的各個階段的很多組織內(nèi)均有表達，包括花、花芽、莖、蓮座葉、根和果莢，且不同組織存在表達差異,有報道對AtNHX6基因啟動子進行分析，也得到類似結(jié)果[29]。本研究通過對幼苗期不同生長時間的植株GUS染色發(fā)現(xiàn)，proNHX5不僅正確啟動GUS基因表達，而且使GUS在不同生長時間幼苗各個部位的表達強弱存在差異。在幼苗期，子葉和莖中從萌發(fā)第1天開始就有GUS表達，而根中早期并未檢測到GUS表達，直到生長到的第6天，根中有些部位才開始檢測到GUS表達(圖5)。生長6 d、9 d、12 d的幼苗中發(fā)現(xiàn)，在莖頂端分生組織處有較強的GUS表達，且在第6天左右真葉開始長出，隨著植株生長，真葉中GUS表達區(qū)域和強度逐漸變小和減弱，到成株時只在葉尖檢測到微弱的GUS表達。前面啟動子分析也發(fā)現(xiàn)，在proNHX5序列里內(nèi)有分生組織表達調(diào)控元件存在，這正好與GUS在莖頂端分生組織強表達相一致，這也暗示根中出現(xiàn)GUS表達的部位很可能也與分生組織有關(guān)。雖然在根尖和側(cè)根中未檢測到GUS表達，但有報道顯示，與AtNHX5高度同源且功能冗余的內(nèi)膜反向轉(zhuǎn)運體的另一個成員AtNHX6的啟動子在根尖和側(cè)根原基部位驅(qū)動GUS強表達[3,29- 30]，這可能是導(dǎo)致proNHX5驅(qū)動GUS表達在根中一些分生組織極不明顯的原因。在成株中，莖中仍具有明顯的GUS表達，而花中GUS表達隨著生長發(fā)育發(fā)生變化，花序頂端花中未檢測到GUS表達，而發(fā)育成熟花中具有明顯的GUS表達，尤其雌蕊柱頭、花柱和花瓣微管組織中。果莢中GUS也隨果莢生長發(fā)育表現(xiàn)表達部位和強度差異，隨著果莢發(fā)育從開始的果柄、果皮、果莢頂端和基部中明顯GUS表達到僅在果柄有微弱表達。整個GUS染色結(jié)果顯示，在擬南芥整個生長過程中，proNHX5驅(qū)動的GUS表達具有明顯的時空特異性，預(yù)示著AtNHX5基因在擬南芥中也具有相同的表達模式，表明AtNHX5在擬南芥生長發(fā)育各個階段都發(fā)揮著重要作用。