尹 躍，趙建華，何昕孺，梁曉婕，安 巍，秦小雅，曹有龍

(寧夏農(nóng)林科學(xué)院 國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心，銀川 750002)

中國(guó)是枸杞(LyciumbararumL.)原產(chǎn)地和最大生產(chǎn)國(guó)。枸杞屬于異花授粉，存在雜合度較高、雜交后代性狀不穩(wěn)定等問(wèn)題。目前，通過(guò)人工雜交選育的品種僅有‘寧杞菜1號(hào)’[1]，而推廣種植面積大的品種‘寧杞1號(hào)’‘寧杞5號(hào)’‘寧杞7號(hào)’和‘寧農(nóng)杞9號(hào)’等[2-5]新品種都是通過(guò)群體選優(yōu)，使得枸杞品種資源間的遺傳結(jié)構(gòu)狹窄，遺傳多樣性較低[6-8]。雜交育種是常規(guī)育種手段，促進(jìn)親本基因重組，創(chuàng)造豐富的遺傳變異。相比較其他茄科植物，如番茄、辣椒等[9-10]，枸杞雜交育種還存在育種方法和技術(shù)的滯后，育成中間材料少等問(wèn)題。因此，要充分重視枸杞雜交育種工作，創(chuàng)制更多育種中間材料，充分挖掘和利用中國(guó)野生枸杞資源的優(yōu)勢(shì)。

雜種鑒定是雜交育種一項(xiàng)重要工作環(huán)節(jié)，其主要目的是降低育種成本，提高育種效率。傳統(tǒng)的雜種鑒定方法有形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)等[11-12]，這些方法具有周期長(zhǎng)及成本高等特點(diǎn)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)快速發(fā)展，分子標(biāo)記(SSR和SNP)技術(shù)日趨完善，為快速完成雜種鑒定提供技術(shù)支撐。SSR標(biāo)記具有共顯性遺傳、多態(tài)性高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于龍眼、沙田柚、月季、老芒麥、黃麻和馬鈴薯等[13-17]植物雜交后代鑒定，但在枸杞雜交種鑒定方面還沒(méi)有報(bào)道。本研究以黃果枸杞(P1)為父本，北方枸杞(P2)為母本，進(jìn)行人工雜交獲得91個(gè)F1單株遺傳分離群體。采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)該群體進(jìn)行雜種真實(shí)性鑒定和遺傳變異分析，以期為進(jìn)一步利用該群體開(kāi)展遺傳學(xué)研究和分子輔助育種提供材料和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雜交親本材料以黃果枸杞(L.bararumvar.auranticarpum，以P1表示)為父本，北方枸杞(L.chinensevar.potaninii，以P2表示)為母本，二者雜交獲得F1代91個(gè)單株(用F1-2，F(xiàn)1-3，……，F(xiàn)1-187表示)，全部定植于寧夏農(nóng)林科學(xué)院國(guó)家枸杞種質(zhì)庫(kù)(38°38′49″N，106°9′10″E)。2017年4月采集幼嫩葉片，立即放入液氮中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室提取DNA。

66對(duì)SSR引物序列來(lái)源枸杞全基因組測(cè)序所開(kāi)發(fā)，由國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心功能基因?qū)嶒?yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取及檢測(cè) 采用試劑盒法(天根，DP305-02)提取基因組DNA，10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，用分光光度計(jì)(Eppendorf,BioPhotometer plus)將工作液質(zhì)量濃度稀釋至100 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增檢測(cè)體系 PCR擴(kuò)增反應(yīng)在ABIGene Amp 9600 PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。擴(kuò)增體系15 μL：DAN模板1 μL，10×Buffer 1.5 μL，dNTP 0.6 μL，上下游引物各0.2 μL，Taq酶 0.1 μL，M13引物1 μL，最后用ddH2O補(bǔ)足至15 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃變性5 min； 94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；94 ℃ 變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，15個(gè)循環(huán)；最后60 ℃延伸30 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：取1 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入到含有9 μL(0.5∶8.5)分子量?jī)?nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液的96孔板中，95 ℃變性3 min，ABI3730上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 雜交后代的SSR鑒定 利用66對(duì)SSR引物對(duì)親本及隨機(jī)挑選2個(gè)F1單株進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出具有雙親互補(bǔ)型雜合位點(diǎn)的引物用于雜交后代鑒定，擴(kuò)增結(jié)果中具有雙親特異位點(diǎn)雜交后代即為真雜種[13]，對(duì)于雙親位點(diǎn)缺失雜交后代需要進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證。

1.2.4 雜交后代遺傳分析 利用GeneMapper 4.0軟件獲取擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小，用DataFormater 2.7軟件[18]進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化整理并轉(zhuǎn)化為NTSYS-pc 2.10軟件[19]輸入格式，并由該軟件計(jì)算Nei 72遺傳距離。將Nei 72遺傳距離矩陣導(dǎo)入MEGA 6.06[20]軟件，采用UPGMA法構(gòu)建聚類(lèi)圖，最后使用iTOL軟件(https://itol.embl.de/)在線編輯美化。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交后代獲得

2015年5-6月采用常規(guī)雜交方法進(jìn)行雜交，以‘黃果枸杞’為父本，‘北方枸杞’為母本，將獲得雜交種子于2015年11月在溫室進(jìn)行催芽、播種和穴盤(pán)育苗。2016年4月移栽至田間，株行距為0.5 m×3 m，統(tǒng)一肥水管理水平。從定植幼苗到結(jié)果期間有部分雜交后代死亡，最后獲得成活雜交后代91個(gè)F1單株。觀察其果實(shí)性狀變異，果實(shí)有紅色長(zhǎng)柱形、黃色長(zhǎng)柱形、黃色近圓形和紅色近圓形等，表型變異豐富(圖1)。

2.2 特異性引物篩選

66對(duì)SSR引物在父母本及隨機(jī)挑選的4個(gè)子代中進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出雙親互補(bǔ)型特異位點(diǎn)引物6對(duì)(表1,圖2 )，利用這6對(duì)引物進(jìn)行雜交后代鑒定分析。

A為雜交親本 Parents，P1為父本 Male，P2為母本 Female；B為部分雜交后代 Some of hybrid offspring

引物名稱(chēng)Primer name重復(fù)單元Repeats上游引物序列(5'→3')Forward primer sequence下游引物序列(5'→3')Reverse primer sequenceLBSSR0001(AGA)17TTTCTATGCTGGATAGGATTCCTAGACCCAAATACTGCCTTCTTAACCLBSSR0046(ATG)13TTCGAGTCCATGTTTACTAAGAGCTCTCATAAGCTTCGGAGTCTCTGLBSSR0103(ATA)16GGTTCAACATACAGACAGTCCTACAACTAGAACTTCCGATCCTTCCAGLBSSR0249(TTC)14CTCTGAGTGCGTCCACTTGAGACAATGGTTGAACGAGTGAGAAGLBSSR0256(TTC)21TCATCTTCTCACTTGCAATTACAGTGATGAACTGCTAGTGAGCTTGALBSSR0276(GAA)16GAAGATAAAGGGAAAGACATGGTTTTACTTCCAATTCACGCTTCA

A為引物L(fēng)BSSR0001 Primer LBSSR0001; B為引物L(fēng)BSSR0046 Primer LBSSR0046; C為引物L(fēng)BSSR0103 Primer LBSSR0103; D為引物L(fēng)BSSR0249 Primer LBSSR0249; E為引物L(fēng)BSSR0256 Primer LBSSR0256; F為引物L(fēng)BSSR0276 Primer LBSSR0276

圖2 雙親互補(bǔ)型雜合位點(diǎn)
Fig.2 Parental complementary heterozygous loci

2.3 F1 群體SSR的鑒定

利用篩選出6對(duì)雙親互補(bǔ)特異位點(diǎn)的引物對(duì)91個(gè)單株進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果顯示：91個(gè)單株中，其中有83個(gè)單株在6個(gè)SSR位點(diǎn)上都有雙親互補(bǔ)型雜合位點(diǎn)(圖3)，可被認(rèn)定為真雜種，雜種率為91.2%，8個(gè)單株出現(xiàn)異常SSR基因型(表2)。

圖3 6對(duì)SSRs引物對(duì)單株F1 -2擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification results of six pairs of SSRs primer for F1 -2

在8個(gè)F1單株基因型中，有5株在引物L(fēng)BSSR0256出現(xiàn)一條帶為父本帶，另一條帶為新擴(kuò)增條帶；2株(F1-29、F1-104)在引物L(fēng)BSSR0046和LBSSR0276中出現(xiàn)一條為母本帶，另一條為新擴(kuò)增條帶；1株F1-173號(hào)在LBSSR0046、LBSSR0249、LBSSR0256和LBSSR0276這4個(gè)位點(diǎn)中均出現(xiàn)1個(gè)親本1條帶，另一個(gè)親本2條帶，推測(cè)其可能為3倍體或非整倍體，需要結(jié)合細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.4 親本與F1 群體的聚類(lèi)分析

根據(jù)SSR鑒定結(jié)果，剔除出現(xiàn)異?；蛐偷?個(gè)單株。根據(jù)6對(duì)引物在2個(gè)親本和83個(gè)單株擴(kuò)增結(jié)果構(gòu)建(0，1)矩陣，計(jì)算供試材料間Nei72遺傳距離，采用UPGMA法構(gòu)建聚類(lèi)圖(圖4)。結(jié)果顯示：2個(gè)親本間的遺傳背景較大，遺傳距離為0.98；83株F1雜種間的遺傳距離為0.00～0.75。在遺傳距離為0.712處可將83株F1劃分為2大類(lèi)：第Ⅰ大類(lèi)與父本聚類(lèi)在一起，共38株，占45.8%；第Ⅱ大類(lèi)與母本聚類(lèi)在一起，共45株，占54.2%。在遺傳距離為 0.636處可進(jìn)一步將第Ⅰ類(lèi)F1細(xì)分為2個(gè)亞類(lèi)，第Ⅱ類(lèi)F1細(xì)分為2個(gè)亞類(lèi)。聚類(lèi)分析結(jié)果表明，雜交后代產(chǎn)生了廣泛的遺傳變異，多樣性豐富。

表2 6對(duì)引物檢測(cè)到雜交后代異?；蛐蚑able 2 Six pairs of primers detected abnormal genotypes of hybrid offspring

圖4 雜交親本與F1 代聚類(lèi)圖Fig.4 Dendrogram of parents and eighty-three progenies

3 討 論

3.1 雜交后代真實(shí)性鑒定

隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，大量SSR標(biāo)記被開(kāi)發(fā)及應(yīng)用于雜交后代鑒定[16-17]，由于SSR標(biāo)記呈現(xiàn)共顯性，理論上選用1對(duì)特異性引物就可以鑒定出真假雜種，真雜種表現(xiàn)為雙親互補(bǔ)型[13]。本試驗(yàn)利用篩選出6對(duì)雜合顯性引物對(duì)91個(gè)F1單株鑒定，其中8個(gè)F1單株出現(xiàn)異常基因型(父本特異條帶缺失或新增條帶)，其余83株均為真雜種，雜種效率為 91.2%。條帶缺失可能是由于配子形成過(guò)程中染色體的交換及DNA分子堿基修飾引起的突變[13]。另外，F(xiàn)1-173在4個(gè)SSR位點(diǎn)(LBSSR0046、LBSSR0249、LBSSR0256和LBSSR0276)出現(xiàn)1個(gè)親本1條帶，另一個(gè)親本2條帶，其推測(cè)可能為非整倍體，需要結(jié)合細(xì)胞學(xué)進(jìn)行鑒定證實(shí)。本試驗(yàn)首次基于枸杞全基因組序列開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記對(duì)枸杞雜交后代鑒定，將為雜交群體保存及開(kāi)展高密度遺傳圖譜構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

3.2 親本與雜交后代遺傳多樣性分析

性狀遺傳分離是雜交育種的重要基礎(chǔ)。枸杞雜交育種工作起步較晚，雜交后代性狀遺傳規(guī)律研究滯后。何軍等[21]研究表明，枸杞雜交后代果實(shí)大小性狀屬于數(shù)量性狀。本試驗(yàn)中2個(gè)親本間的遺傳差異較大，遺傳距離為0.98。這與本課題組前期利用iPBS進(jìn)行枸杞種質(zhì)資源多樣性分析中‘北方枸杞’與‘黃果枸杞’親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的結(jié)果相一致[22]。北方枸杞果色為黃色，果形為長(zhǎng)柱形，平均單果質(zhì)量為0.7 g，果形指數(shù)為2.5；黃果枸杞果色為黃色，果形為圓形，平均單果質(zhì)量為0.34 g，果形指數(shù)為1.4。通過(guò)雜交，其雜交后代產(chǎn)生了顯著的遺傳變異。在遺傳距離為0.712處，將83個(gè)真雜種分為2大類(lèi)，第Ⅰ大類(lèi)與父本聚為一類(lèi)，占45.8%，第Ⅱ大類(lèi)與母本聚為一類(lèi)，占54.2%。雜種間存在豐富遺傳多樣性。田間表型觀察結(jié)果，F(xiàn)1代果實(shí)表現(xiàn)為黃色長(zhǎng)柱形、紅色近圓形等，果實(shí)性狀分離明顯。這將為下一步利用該群體構(gòu)建高密度分子遺傳圖譜，開(kāi)展果色性狀精細(xì)定位和相關(guān)基因挖掘研究提供參考，以期解析枸杞果實(shí)顏色性狀遺傳調(diào)控。