董 娜，胡海燕，胡鐵柱，李 淦，李小軍，陳向東，張亞娟，茹振鋼

(河南科技學院 小麥中心，現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南省高等學校作物分子育種重點開放實驗室，河南新鄉(xiāng) 453003)

小麥條銹病是由條形柄銹菌小麥?；?Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的真菌病害，具有流行速度快、分布范圍廣等特點，在中國曾發(fā)生多次大流行，是嚴重影響小麥生產(chǎn)的重要常發(fā)病害之一[1]。一般流行年份小麥減產(chǎn)10%～20%，較大流行年份減產(chǎn)超過30%，嚴重的甚至顆粒無收。如2002年全國小麥條銹病大流行，發(fā)病面積近670萬hm2，遍及甘、陜、川、渝、云、貴、寧、鄂、豫、魯、冀11個省(區(qū))，小麥產(chǎn)量損失約10億kg[2]。

實踐證明，培育和利用抗病品種是控制小麥條銹病最經(jīng)濟、有效和環(huán)境安全的措施[3-5]。迄今，國際上已發(fā)現(xiàn)100多個抗小麥條銹病基因，正式命名編號至Yr79[6-7]。然而，由于小麥條銹菌群體結(jié)構(gòu)復雜，新毒性小種不斷形成，抗病基因會因為條銹病菌毒力頻率變化或新的毒力型的出現(xiàn)而喪失抗性[8-9]。例如，Yr1、Yr2、Yr6、Yr7、Yr8、Yr9、Yr17等在中國已喪失抗性，最近幾年由于條銹病菌新致病類型V26(目前未正式命名)的出現(xiàn)，Yr24/Yr26類抗源也喪失抗性[10]。因此，發(fā)掘新的抗條銹病基因，拓寬抗性基因遺傳資源，對中國小麥抗條銹病育種至關(guān)重要。

國內(nèi)學者在抗條銹病基因有效性評價和抗病種質(zhì)資源篩選方面開展了大量基礎(chǔ)性工作。王樹和等[11]利用苗期抗病性鑒定和分子標記技術(shù)，評價了100個四川省近年小麥生產(chǎn)品種和后備品種對條銹菌流行小種的抗性水平，以及Yr5、Yr9等已知基因在該地區(qū)的分布狀況。孫建魯?shù)萚12]對100個小麥品種資源進行了抗條銹性鑒定和重要抗條銹病基因的SSR檢測，從中篩選出具有穩(wěn)定抗病性的品種8個。侯璐等[13]通過苗期分小種接種和大田成株期自然誘發(fā)，對81份春小麥種質(zhì)資源的抗條銹性進行評價，鑒定出全生育期抗性資源7份，成株期抗性資源39份。曾慶東等[10]利用當前流行頻率最高的條銹菌生理小種CYR32和CYR33，以及對Yr26有毒性的新菌系V26/CM42，通過對攜帶已知抗條銹病基因的小麥材料進行苗期和成株期抗病性鑒定，評估了各已知Yr基因在中國抗條銹病育種中的有效性。韓德俊等[14]通過對1 980份小麥地方品種和國外種質(zhì)進行抗條銹性鑒定與評價，篩選出具有全生育期抗性的種質(zhì)8份，具成株期抗性的種質(zhì)42份。李峰奇等[15]通過對黃淮麥區(qū)126個小麥品種(系)進行條銹病抗性鑒定和抗病基因分子標記檢測，發(fā)現(xiàn)黃淮麥區(qū)小麥品種對當前條銹菌流行小種的抗性水平較低，對新小種抗性良好的Yr5、Yr10等基因分布頻率很低。這些研究對小麥抗條銹病育種具有重要意義。

小麥抗條銹病基因Yr5、Yr10和Yr18對當前條銹病流行小種仍保持一定抗性。因此，本研究利用與抗條銹病基因Yr5、Yr10和Yr18共分離或緊密連鎖的分子標記S1320[16]、SC200[17]和csLV34[18]，對河南科技學院小麥中心收集的348份小麥種質(zhì)進行檢測，了解現(xiàn)有育種材料中抗性基因Yr5、Yr10和Yr18的分布狀況，同時結(jié)合田間鑒定對種質(zhì)材料的抗病性進行評價，以期為小麥抗條銹病材料的合理利用以及抗條銹病基因聚合育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 小麥種質(zhì)與條銹病菌 348份小麥種質(zhì)均為育成品種(系)，由河南科技學院小麥中心收集和保存，其中114份來源于河南省各育種單位，其余234份收集于全國多個麥區(qū)。條銹病菌為生產(chǎn)上流行小種CYR32和CYR33混合菌株，購自中國農(nóng)科院植保所。

1.1.2 主要試劑與儀器 2×TaqMaster Mix購自北京康為世紀生物科技有限公司；Gene Amp PCR System 9700型PCR儀購自ABI；試驗所用的分子標記引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司合成，其序列見表1。

表1 標記及序列Table 1 Markers and their sequences used in this research

1.2 方 法

1.2.1 小麥種質(zhì)的種植及條銹病抗性調(diào)查 所有小麥種質(zhì)均種植于河南科技學院小麥中心位于新鄉(xiāng)市輝縣的種質(zhì)圃中，每份種質(zhì)播種兩行，行長4 m，畦埂上種誘發(fā)行(‘石家莊8號’)，常規(guī)田間管理，第二年春季小麥返青后取樣檢測。于3月中下旬小麥拔節(jié)期，采用孢子懸液注射法進行條銹菌接種，每行接種1個分蘗，灌漿初期調(diào)查條銹病發(fā)病情況，病級劃分采用0～4級法[19]。條銹病抗性于2014-2017年連續(xù)調(diào)查3 a，病級按發(fā)病最重的統(tǒng)計。

1.2.2 基因組DNA提取 取0.2 g左右小麥幼苗葉片放入1.5 mL離心管中，液氮冷凍研磨后，采用CTAB法[20]提取基因組DNA，DNA提取效果通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 分子標記檢測 PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2×TaqMaster Mix 10 μL，10 μmol/L特異引物各0.5 μL，DNA模板50～100 ng，剩下用ddH2O補足。S1320的擴增程序為94 ℃預(yù)變性5 min，(94 ℃變性50 s、60℃退火50 s、72 ℃延伸50 s)×36，72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存；擴增產(chǎn)物在170V下經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h左右，銀染、顯影后利用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果并拍照保存。SC200和csLV34的擴增程序為94℃預(yù)變性5 min，(94 ℃變性50 s、55 ℃退火50 s、72 ℃延伸50 s)×36，72 ℃終延伸10 min， 4 ℃保存。擴增產(chǎn)物在110 V下經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠(含goldview染料)電泳40 min左右，然后利用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果并拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 Yr5基因的分子標記檢測

檢測Yr5基因用的是與其共分離的SCAR標記S1320，攜帶Yr5基因的種質(zhì)能夠擴增出156 bp的DNA條帶(圖1)。檢測結(jié)果表明，在348份小麥種質(zhì)中能夠擴增出目標DNA條帶的有122份，說明這122份種質(zhì)攜帶有Yr5基因，其余226份種質(zhì)中未擴增出預(yù)期大小的DNA條帶，說明這些種質(zhì)未攜帶該基因，檢出率為35.06%。

M.100 bp marker；1～36.部分檢測樣品 Partial samples detected；37.陽性對照 Positive control；箭頭所指為目標條帶 The arrow shows the target band

圖1Yr5基因的分子標記檢測結(jié)果
Fig.1 PCR pattern amplified by SCAR marker ofYr5

2.2 Yr10基因的分子標記檢測

檢測Yr10基因用的是與其緊密連鎖的SCAR標記SC200，二者的連鎖距離為0.5 cM，攜帶Yr10基因的種質(zhì)能夠擴增出大小約200 bp和180 bp的兩條DNA條帶，未攜帶該基因的種質(zhì)只能擴增出約180 bp的一條帶(圖2)。在檢測的348份小麥種質(zhì)中，能夠擴增出目標DNA條帶的有80份，說明這80份種質(zhì)攜帶有Yr10基因，其余268份種質(zhì)沒有擴增出預(yù)期大小的DNA條帶，說明這些種質(zhì)未攜帶該基因，檢出率為22.99%。

2.3 Yr18基因的分子標記檢測

利用與Yr18基因緊密連鎖的STS標記csLV34對其進行分子檢測，二者的連鎖距離為0.4 cM，攜帶Yr18基因的種質(zhì)能夠擴增出150 bp的DNA條帶，未攜帶該基因的種質(zhì)擴增的條帶為229 bp(圖3)。檢測結(jié)果表明，在348份小麥種質(zhì)中能夠擴增出目標DNA條帶的有7份，說明這7份種質(zhì)攜帶有Yr18基因，其余341份種質(zhì)沒有擴增出預(yù)期大小的DNA條帶，說明這些種質(zhì)未攜帶該基因，檢出率為2.01%。

M.100 bp marker；1.陽性對照 Positive control；2～24.部分檢測樣品 Partial samples detected；箭頭所指為目標條帶 The arrow shows the target band

圖2Yr10基因的分子標記檢測結(jié)果
Fig.2 PCR pattern amplified by SCAR marker ofYr10

2.4 含 Yr5、 Yr10和 Yr18種質(zhì)的條銹病抗性分析

條銹病抗性鑒定結(jié)果表明：攜帶Yr5的122份種質(zhì)中，表現(xiàn)中抗及以上的有27份，所占比例為22.13%，其中‘CP02-8-5-6-2-1’‘內(nèi)麥9號’‘黔9963-3’‘農(nóng)大189選’‘CP20-38’‘07Bh032’和‘B70041-1-2’表現(xiàn)近免疫；攜帶Yr10的80份種質(zhì)中，表現(xiàn)中抗及以上的有11份，所占比例為 13.75%，其中‘渝0822’表現(xiàn)近免疫；攜帶Yr18的7份種質(zhì)中，有3份表現(xiàn)中抗及以上，所占比例為 42.86%，其中‘07Bh032’和‘CA57’表現(xiàn)近免疫(表2)。從這些結(jié)果可以看出，攜帶抗病基因的種質(zhì)中抗病性表現(xiàn)并不一致，Yr18的抗性較為穩(wěn)定，其次為Yr5，而Yr10僅在少數(shù)遺傳背景中具有抗性。

M.100 bp marker；1.陽性對照 Positive control；2～24.部分檢測樣品 Partial samples detected；箭頭所指為目標條帶 The arrow shows the target band

圖3 Yr18基因的分子標記檢測結(jié)果Fig.3 PCR pattern amplified by STS marker of Yr18

注：“√”代表陽性；下同。

Note: “√” represents positive; the same below.

在檢測的348份種質(zhì)中，抗病基因聚合種質(zhì)有37份，其中Yr5、Yr10和Yr183基因聚合的種質(zhì)1份，Yr5和Yr10聚合的種質(zhì)32份，Yr5、Yr18聚合和Yr10、Yr18聚合的種質(zhì)各2份(表3)?？共』蚓酆戏N質(zhì)的條銹病抗性鑒定結(jié)果表明：在Yr5和Yr18聚合時，條銹病抗性表現(xiàn)較好，2份種質(zhì)中‘09P131’表現(xiàn)中至高抗，‘07Bh032’表現(xiàn)近免疫。含有Yr10的各類聚合種質(zhì)共35份，其中Yr5和Yr10聚合的32份種質(zhì)中僅‘陜農(nóng)981’‘抗赤6號’和‘抗白3號’表現(xiàn)中抗，其余表現(xiàn)中至高感，Yr10、Yr18聚合的2份種質(zhì)和Yr5、Yr10、Yr183基因聚合的1份種質(zhì)均表現(xiàn)中至高感，說明Yr10和Yr5或Yr18聚合后沒有有效提高這些種質(zhì)的條銹病抗性。

表3 抗病基因聚合種質(zhì)及其抗病性Table 3 The wheat germplasms carrying pyramiding disease resistant genes and their disease resistance

此外，有10份種質(zhì)‘內(nèi)麥836’‘豐優(yōu)7號’‘川農(nóng)05152’‘W3734’‘09品E2’‘農(nóng)大8P593’‘CP02-9-2-2’‘CP02-3-5-5’‘04中77’和‘云麥57’，雖然未檢出上述3個基因，但是對條銹病表現(xiàn)近免疫，這些種質(zhì)主要來自四川、北京和云南等地，是抗條銹病育種的重要資源，后續(xù)會進行深入研究。

2.5 348份種質(zhì)中 Yr5、 Yr10和 Yr18的分布

共檢測3個小麥抗條銹病基因Yr5、Yr10和Yr18，在這348份小麥種質(zhì)中，Yr5的檢出率最高，主要分布在安徽、寧夏、陜西、山東、江蘇等省的種質(zhì)中，安徽和寧夏種質(zhì)中Yr5的檢出率達到了100%，可能跟這些地方搜集的種質(zhì)較少有關(guān)；其次是Yr10，主要分布在內(nèi)蒙、安徽、山東、陜西、河北的種質(zhì)中；Yr18的檢出率最低，僅有7份種質(zhì)攜帶該基因，分布于江蘇、北京和山東的種質(zhì)中(表4)。從3個基因的總體分布來看，陜西、河南、山東、江蘇、河北和北京來源的種質(zhì)中抗病基因分布較多，抗病基因聚合種質(zhì)也較多，其中含抗病基因且表現(xiàn)抗病的種質(zhì)則主要來自陜西、北京和江蘇(表2、3、4)。

表4 348份種質(zhì)中 Yr5、 Yr10和 Yr18的分布情況Table 4 The distribution of Yr5, Yr10 and Yr18 among 348 wheat germplasms

注：“-”代表無。

Note: “-” represents none.

3 討論與結(jié)論

種質(zhì)資源抗病性的有效評價是小麥抗病育種的重要基礎(chǔ)，基于PCR的分子標記技術(shù)的發(fā)展，為種質(zhì)資源中抗病基因組成的快速鑒定提供了有效手段，在輔助育種中已有較多應(yīng)用。本研究通過分子標記輔助檢測，初步明確了河南科技學院小麥中心保存的348份種質(zhì)中抗條銹病基因Yr5、Yr10和Yr18的分布情況，并結(jié)合田間鑒定對這些種質(zhì)的條銹病抗性進行了評價。

STS標記csLV34在輔助檢測抗條銹病基因Yr18中已有較多應(yīng)用。楊文雄等[21]、白小軍等[22]、任妍等[23]、伍玲等[24]用該標記從種質(zhì)資源中鑒定攜帶Yr18的材料，分子標記檢測陽性的種質(zhì)對條銹病具有較好的抗性。董娜等[19]也曾用該標記從39份外引種質(zhì)中鑒定出6份攜帶Yr18的種質(zhì)，且對條銹病菌表現(xiàn)近免疫至中抗。但本研究中，標記csLV34陽性的7份種質(zhì)抗病性表現(xiàn)并不一致，表現(xiàn)中抗及以上的只有3份。在用SCAR標記S1320和SC200檢測Yr5和Yr10時，標記陽性的種質(zhì)抗病性表現(xiàn)也不一致。標記S1320陽性的122份種質(zhì)中表現(xiàn)中抗及以上的有27份，標記SC200陽性的80份種質(zhì)中，表現(xiàn)中抗及以上的有11份，與之前用這些標記檢測外引種質(zhì)的結(jié)果類似。韓德俊等[14]在利用緊密連鎖的分子標記STS7/8對抗條銹病基因Yr5進行檢測，王樹和等[11]在用SCAR標記Yr10F/R對Yr10基因進行檢測時均發(fā)現(xiàn)標記陽性種質(zhì)抗病性表現(xiàn)不同的情況。因此，利用這些分子標記進行輔助育種時，必須結(jié)合接種鑒定的結(jié)果綜合判斷。同時也期待隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展，開發(fā)出越來越多穩(wěn)定可靠的抗病基因功能標記用于輔助育種。

在檢測的3個抗條銹病基因中，慢銹性基因Yr18的檢出率最低，348份種質(zhì)中僅有7份攜帶該基因，這與楊文雄等[21]、李敏州等[25]、Zeng等[26]的研究結(jié)果基本一致。Yr18在中國育成品種(系)分布頻率低跟過去在品種選育中過分強調(diào)高抗或免疫的主效基因的選擇，忽視了慢病基因的利用有關(guān)。從抗病基因聚合種質(zhì)的抗病性鑒定結(jié)果來看，Yr5和Yr18聚合時抗病性表現(xiàn)非常好，Yr10與Yr5或Yr18聚合則不能有效提高種質(zhì)的抗病性，在小麥抗條銹病育種中可以通過將Yr5與Yr18聚合來提高小麥品種的條銹病抗性以及延緩抗病品種的使用壽命。從抗病種質(zhì)的分布來看，含抗條銹病基因Yr5、Yr10或Yr18且表現(xiàn)抗病的種質(zhì)主要來自陜西、北京和江蘇，收集于小麥主產(chǎn)區(qū)河南的種質(zhì)最多，但含上述抗病基因且表現(xiàn)抗病的種質(zhì)則較少，因此還需進一步加強適于小麥主產(chǎn)區(qū)的抗條銹病種質(zhì)的創(chuàng)制與利用。