賈冬冬，王京宏，崔桂賓，張舒夢(mèng)，張 超，孫風(fēng)麗，王竹林，奚亞軍

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 陜西楊凌 712100；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北地區(qū)小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西楊凌 712100)

現(xiàn)階段小麥再生效率低，遺傳轉(zhuǎn)化相對(duì)困難，已經(jīng)成為制約小麥功能基因組研究的主要障礙之一。高效的組織培養(yǎng)再生體系對(duì)于推進(jìn)運(yùn)用轉(zhuǎn)基因和基因編輯技術(shù)改良小麥品種具有重要意義。植物離體組織培養(yǎng)是一個(gè)復(fù)雜的無(wú)性繁殖過(guò)程, 通常包括愈傷組織的誘導(dǎo)和分化再生[1]。離體再生過(guò)程受到內(nèi)外多種因素的影響，來(lái)自外部的誘導(dǎo)因子主要有外源激素、環(huán)境脅迫(包括氧化脅迫、滲透脅迫等)、培養(yǎng)基生化添加物等[2]，而基因型是影響組織培養(yǎng)的重要內(nèi)部因素，其與再生能力及遺傳轉(zhuǎn)化率密切相關(guān)[3-4]。因此，挖掘并克隆、轉(zhuǎn)化小麥再生相關(guān)基因，不但有助于提高小麥優(yōu)良基因型的再生能力和小麥組織培養(yǎng)再生率及轉(zhuǎn)化效率，極大地減少組織培養(yǎng)工作量，而且利用來(lái)自小麥自身的再生相關(guān)基因作為篩選標(biāo)記,可以獲得無(wú)抗生素等篩選標(biāo)記的安全型轉(zhuǎn)基因植株, 有利于轉(zhuǎn)基因小麥的安全性評(píng)價(jià)和商業(yè)化種植, 是一個(gè)極具價(jià)值的研究方向[5]。

小麥屬于異源六倍體作物，遺傳組成異常復(fù)雜，因此要篩選并克隆出控制小麥組織培養(yǎng)再生的主效基因極其困難。在模式物種擬南芥中已克隆了一些與體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)基因，主要分為兩類(lèi)：(1)控制胚胎發(fā)育特征相關(guān)基因主要包括LEC1、LEC2、FUS3、AGL15等[6-12]和WOXs家族基因WOX5、WOX 11、WOX 12等[13-14]，以及AP2/ERF型轉(zhuǎn)錄因子BBM、EMK、WIND1、ESR1、PLT、ARRS等[15-20]；(2)與芽頂端分生組織相關(guān)的基因有STM、CLV3、WUS等[21-27]。在其他作物中也有與體外再生和胚胎發(fā)育相關(guān)的基因報(bào)道。Schmidt等[28]在胡蘿卜中首次發(fā)現(xiàn)調(diào)控體細(xì)胞向胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)變的體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)類(lèi)受體蛋白激酶關(guān)鍵基因SERK；Nishimura等[29]從高再生水稻Kasalath品種成功分離到控制其再生相關(guān)的主效基因鐵氧還蛋白-亞硝酸還原酶基因(Ferredoxin-nitrite reductase,NiR)。研究表明通過(guò)異位表達(dá)再生相關(guān)基因在某種程度上可以啟動(dòng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生及提高植物再生能力[30-31]。杜邦先鋒公司利用磷脂轉(zhuǎn)移酶蛋白基因啟動(dòng)子PLTP和生長(zhǎng)素誘導(dǎo)啟動(dòng)子Axig1分別驅(qū)動(dòng)玉米轉(zhuǎn)錄因子BBM和WUS2，可使農(nóng)桿菌侵染后的玉米幼胚快速形成大量體細(xì)胞胚，這些體胚可以直接被轉(zhuǎn)化并長(zhǎng)成植株而不需要經(jīng)過(guò)愈傷誘導(dǎo)階段，從而將遺傳轉(zhuǎn)化的時(shí)間縮短至1個(gè)月且不依賴(lài)玉米基因型[32]，說(shuō)明啟動(dòng)子和再生基因有效相結(jié)合為解決頑拗型植物困難再生的問(wèn)題提供了一條新的途徑。

目前已通過(guò)同源克隆技術(shù)得到一些與小麥再生相關(guān)的候選基因，如小麥體細(xì)胞胚胎受體類(lèi)激酶基因TaSERKs[33]、亞硝酸還原酶基因TaNiR[2]、過(guò)氧化氫酶基因TaCATs及TaWOX5[3]等，并對(duì)其再生功能進(jìn)行了初步鑒定。然而，目前克隆得到的小麥再生相關(guān)基因均未被確定是控制小麥再生的主效基因。值得注意的是，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所報(bào)道其從小麥品系CB037中鑒定出再生相關(guān)基因TaCB1，該基因與日本煙草公司PureWheat技術(shù)結(jié)合可以顯著提高小麥再生能力及轉(zhuǎn)化效率，而且TaCB1基因共轉(zhuǎn)化小麥幼胚基本上克服了對(duì)小麥基因型的依賴(lài)性，但此專(zhuān)利在小麥組織培養(yǎng)實(shí)踐應(yīng)用中的實(shí)用性及廣泛性有待驗(yàn)證。

Zhang等[34]首次在擬南芥自然變異種中發(fā)現(xiàn)決定其再生能力的一種新的硫氧還蛋白DCC1。DCC1與線(xiàn)粒體呼吸鏈中NADH脫氫酶復(fù)合體(復(fù)合體I)的一個(gè)重要亞基CA2直接相互作用，通過(guò)對(duì)CA2的氧化還原修飾調(diào)控復(fù)合體I活性，DCC1的突變將導(dǎo)致復(fù)合體I的活性降低，誘發(fā)線(xiàn)粒體ROS水平增加，而ROS含量的激增將影響芽分生組織形成相關(guān)基因WUS、STM、CLV3等的表達(dá)，進(jìn)而抑制芽的再生，因此鑒定出硫氧還蛋白DCC1是決定擬南芥再生能力的關(guān)鍵蛋白[25,35]。本試驗(yàn)以小麥品種‘中國(guó)春’為試驗(yàn)材料，采用同源克隆法獲得小麥硫氧還蛋白TaDCC1-2B基因的全長(zhǎng)序列，對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)特性分析，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)該基因的功能進(jìn)行初步鑒定，以期為挖掘小麥再生相關(guān)基因和研究再生作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料及種植條件 試驗(yàn)中用到的擬南芥材料有野生型Columbia-0(Col-0)、擬南芥硫氧還蛋白突變體dcc1 (SALK_051222C)，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)張憲省課題組饋贈(zèng)。Col-0和dcc1種子在4 ℃條件春化3 d后點(diǎn)播于基質(zhì)中，然后將其轉(zhuǎn)移至人工氣候室，培養(yǎng)條件為：溫度設(shè)置為 25 ℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度為150 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度為70%?；蚩寺∷玫男←溎０鍨槠胀ㄐ←湣袊?guó)春’三葉一心期葉片的cDNA。

1.1.2 菌株與載體 試驗(yàn)中所用的大腸桿菌菌株為EscherichiacoliDH5α，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株為GV3101。載體構(gòu)建時(shí)所用的克隆載體為pLB零背景快速克隆試劑盒提供的克隆載體pLB Vector，用于擬南芥轉(zhuǎn)化的過(guò)表達(dá)載體為pGreenⅡ-OE。

1.1.3 主要化學(xué)試劑與儀器 基因擴(kuò)增及菌落PCR過(guò)程中用到的KOD高保真酶、Taq酶及pLB零背景快速克隆試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司(德國(guó))。限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司(馬薩諸塞州，美國(guó))，一步克隆試劑盒(ClonExpress○RII One Step Cloning Kit)和Magen RNA提取試劑盒分別購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司(南京，中國(guó))和廣州美基生物科技有限公司(廣州，中國(guó))。RNA反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司(日本)，引物合成及測(cè)序由楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司(楊凌，中國(guó))完成。使用QuantStudio○R5 Real-Time PCR儀(Thermo Scientific，馬薩諸塞州，美國(guó))進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。

1.2 方 法

1.2.1TaDCC1基因克隆和表達(dá)載體構(gòu)建 以擬南芥硫氧還蛋白DCC1(AT5G50100)的氨基酸序列為探針在Ensemble Plants小麥數(shù)據(jù)庫(kù)(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)進(jìn)行比對(duì)，得到3條高度相似且定位在小麥2A、2B、2D長(zhǎng)臂上的序列，對(duì)應(yīng)的序列號(hào)分別為T(mén)raesCS2A01G540200.1、TraesCS2B01G570 600.1 和TraesCS2D01G541900.1。根據(jù)小麥3條同源序列的保守區(qū)域利用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增同源基因引物。引物序列信息見(jiàn)表1。以‘中國(guó)春’cDNA為模板，使用KOD高保真酶進(jìn)行目的基因序列的PCR擴(kuò)增。利用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收后，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)目的PCR片段濃度，參照pLB零背景快速克隆試劑盒說(shuō)明計(jì)算插入目的片段的使用量，并按照說(shuō)明書(shū)粘性末端連接方法連接載克隆體和目的片段，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑選12個(gè)經(jīng)PCR鑒定條帶正確的陽(yáng)性克隆送至楊凌奧科測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。利用一步克隆試劑盒構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)登錄諾唯贊官網(wǎng)(http://www.vazyme.com)下載引物設(shè)計(jì)軟件 CE Design，根據(jù)說(shuō)明引物設(shè)計(jì)總原則，選擇XhoⅠ和XbaⅠ作為酶切位點(diǎn)，對(duì)插入目的片段設(shè)計(jì)帶有載體末端同源序列 + 酶切位點(diǎn)(可保留或刪除) + 基因特異性擴(kuò)增引物序列的上下游引物，以連接成功的克隆載體為模板，擴(kuò)增插入表達(dá)載體的目的片段，并用XhoⅠ和XbaⅠ對(duì)表達(dá)載體pGreenⅡ-OE質(zhì)粒線(xiàn)性化，凝膠電泳檢測(cè)并回收擴(kuò)增和酶切產(chǎn)物，按照說(shuō)明進(jìn)行重組反應(yīng)，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，利用表達(dá)用載體測(cè)序引物進(jìn)行PCR鑒定陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)，進(jìn)一步PCR鑒定，保存轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌 菌液。

1.2.2TaDCC1基因的表達(dá)量分析TaDCC1基因具有3個(gè)序列高度相似的基因拷貝，利用NCBI在線(xiàn)引物設(shè)計(jì)工具在TaDCC1-2A、TaDCC1-2B和TaDCC1-2D序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物對(duì)(表1)，檢測(cè)3個(gè)TaDCC1基因在小麥中的相對(duì)表達(dá)量；以Actin為小麥內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)引物Actin-F/Actin-R序列見(jiàn)表1。qRT-PCR體系參照參照TaKaRa定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，循環(huán)數(shù)為40，退火溫度為60 ℃，延伸時(shí)間35 s。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行基因表達(dá)分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用ANOVA分析方法進(jìn)行Duncan’s test測(cè)驗(yàn)，并利用GraphPad Prism7軟件(加州大學(xué)圣地亞哥分校，美國(guó))進(jìn)行作圖。

1.2.3TaDCC1-2B基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析 運(yùn)用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)TaDCC1-2B基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，利用ExPASyhttp://web.expasy.org/protparam/在線(xiàn)預(yù)測(cè)蛋白親水性，利用PredictProtein(https://www.predictprotein.org/home)和SWISS MODEL服務(wù)器(http：//swissmodel.expasy.org)對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。以TaDCC1-2B蛋白序列為探針，在NCBI網(wǎng)站搜索不同物種的同源蛋白，利用DNAMAN 6.0(LynnonBiosoft公司，美國(guó))和MEGA 7.0軟件(賓夕法尼亞大學(xué)，美國(guó))進(jìn)行蛋白序列的同源性分析和進(jìn)化分析。系統(tǒng)進(jìn)化分析采用鄰接法 (neighor-joining) 作圖, 重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1 000。

1.2.4TaDCC1-2B基因啟動(dòng)子區(qū)域分析 選取TaDCC1-2B基因起始密碼子ATG上游2 000 bp的潛在啟動(dòng)子區(qū)域，在PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)中預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件。

1.2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥 在擬南芥突變體dcc1開(kāi)花初期，將過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)農(nóng)桿菌(GV3101)感受態(tài)細(xì)胞，利用花序蘸染法侵染dcc1花序，將收獲的轉(zhuǎn)基因T0代種子種植后用除草劑草銨膦篩選，不受除草劑影響的初步認(rèn)定為陽(yáng)性植株，提取其基因組DNA，設(shè)計(jì)草銨膦Bar基因引物(表1)進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.6 擬南芥根尖誘導(dǎo)芽的再生 芽再生試驗(yàn)參照Li等[36]并稍加修改，將野生型Col-0、突變體dcc1和轉(zhuǎn)基因T3代種子經(jīng)過(guò)70%(V/V)乙醇消毒1 min，8%(V/V)的次氯酸鈉渦旋10 min，并用滅菌水沖洗5～8遍，然后用牙簽將種子點(diǎn)播在萌發(fā)培養(yǎng)基(1/2 MS培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%蔗糖、0.5 g·L-1MES和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%瓊脂糖，pH 5.8)，4 ℃春化3 d后，放置在設(shè)置條件為溫度22 ℃、光照18 h/黑暗6 h的光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)12 d至根長(zhǎng)約5～10 mm，切除根尖并轉(zhuǎn)入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(CIM，MS培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%蔗糖、0.5 g·L-1MES 、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%瓊脂糖、0.5 mg·L-12,4-D和 0.05 mg·L-1激動(dòng)素，pH 5.8)，愈傷連續(xù)培養(yǎng)15 d后轉(zhuǎn)入再生芽分化培養(yǎng)基(SIM，MS培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%蔗糖、0.5 g·L-1MES，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%瓊脂糖、0.5 mg·L-12,4-D和0.05 mg·L-12,4-D，pH 5.8)，SIM培養(yǎng)基每 6 d更換1次。由于突變體dcc1在SIM培養(yǎng)基培養(yǎng)第20天時(shí)才誘導(dǎo)分化出再生芽，選擇在分化第25天統(tǒng)計(jì)Col-0、dcc1和T3代的芽再生率。分別進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，每組統(tǒng)計(jì)50個(gè)愈傷。芽再生率=至少分化出一個(gè)芽的愈傷數(shù)目/總愈傷數(shù)×100%。同時(shí)，將此時(shí)期Col-0、dcc1和T3的再生芽?jī)龃嬖?80 ℃冰箱，用于qRT-PCR檢測(cè)。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè) 再生芽總RNA的提取使用Magen RNA提取試劑盒，方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。cDNA第一鏈的合成方法參照Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)。使用QuantStudio○R5 Real-Time PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，PCR反應(yīng)體系(表2)和反應(yīng)程序參照TaKaRa定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)。以WUS(gene ID, At2g17950)作為再生芽標(biāo)記基因，TUB2(gene ID，At5g62690)為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)定量PCR引物(表1)，分析TaDCC1-2B基因及WUS基因在野生型、突變體及轉(zhuǎn)基因擬南芥在SIM誘導(dǎo)分化培養(yǎng)第25天的再生芽的表達(dá)水平。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 s，95 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，30個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 10 s ，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析同“1.2.2”。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

表2 qRT-PCR反應(yīng)體系Table 2 The system of qRT-PCR reaction

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆及過(guò)表達(dá)載體連接凝膠電泳分析

從‘中國(guó)春’cDNA中擴(kuò)增到大小為650 bp左右的條帶(圖1)，對(duì)該條帶進(jìn)行膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、挑菌、測(cè)序后發(fā)現(xiàn)同時(shí)擴(kuò)增得到來(lái)自小麥2A、2B、2D基因組上的3個(gè)同源基因序列，分別命名為T(mén)aDCC1-2A、TaDCC1-2B和TaDCC1-2D，其CDS序列全長(zhǎng)均為645 bp，三者CDS相似度達(dá)到98.40%，氨基酸序列相似度達(dá)98.44%，其中TaDCC1-2B的氨基酸序列和TaDCC1-2A、TaDCC1-2D同源性均達(dá)到97.20%，TaDCC1-2A的氨基酸序列和TaDCC1-2D同源性達(dá)到 96.26%。

M.D2000 Maker；1.目的條帶 Target band

對(duì)利用一步克隆試劑盒構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體進(jìn)行PCR鑒定，測(cè)序引物為表達(dá)載體測(cè)序引物，擴(kuò)增得到約為850 bp的條帶(圖2)，符合目的條帶大小，表明插入的目的片段和線(xiàn)性化載體連接 成功。

2.2 TaDCC1基因的表達(dá)量分析

由圖3可知，以‘中國(guó)春’三葉一心期葉片的cDNA為模板，檢測(cè)TaDCC1-2A、TaDCC1-2B、TaDCC1-2D基因在小麥葉片中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)三者表達(dá)量未表現(xiàn)出顯著差異，說(shuō)明三者在小麥中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。

M.D2000 Maker；1.目的條帶 Target band；2.陰性對(duì)照 Negative control

圖2 PCR鑒定表達(dá)載體陽(yáng)性克隆
Fig.2 PCR identification of positive
clones in expression vector

圖3 TaDCC1基因表達(dá)量分析Fig.3 Expression analysis of TaDCC1 genes

2.3 TaDCC1-2B基因編碼蛋白的生物信息學(xué) 分析

2.3.1 基本理化性質(zhì)分析TaDCC1-2B基因開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)為645 bp，編碼214個(gè)氨基酸，ProtParam預(yù)測(cè)顯示所編碼的蛋白分子式為C1031H1634N302O307S13，分子質(zhì)量為23.59 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為8.94，脂肪系數(shù)71.31，親水性總平均值-0.409，不穩(wěn)定系數(shù)為56.74(>40)，為不穩(wěn)定蛋白。

2.3.2 蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具PredictProtein預(yù)測(cè)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲占59.35%，螺旋結(jié)構(gòu)有32.24%，片層結(jié)構(gòu)有8.41%，無(wú)規(guī)則卷曲是其主要結(jié)構(gòu)元件。利用ProtScale對(duì)該蛋白進(jìn)行親水/疏水性分析，ProtScale Score<0，推測(cè)此蛋白是親水性蛋白(圖4)。利用SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫(kù)采用同源建模的方法析此蛋白，得到三維結(jié)構(gòu)圖(圖5)。

2.3.3TaDCC1-2B基因的氨基酸序列多重比對(duì)及進(jìn)化分析 利用DNAMAN6.0將小麥TaDCC1-2A、TaDCC1-2B、TaDCC1-2D蛋白的氨基酸序列與擬南芥(AT5G50100)、粗山羊草(AET2Gv21183600)、烏拉爾圖小麥(TRIUR3_12911)、大麥(HORVU2Hr1G118360)、野生二粒小麥(TRIDC2BG082500)、二穗短柄草(BRADI_5g25506v3)、玉米(Zm00001d001910)、水稻(Os04t0668800)的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)。結(jié)果表明小麥TaDCC1蛋白序列與其他物種序列類(lèi)似，氨基酸N端列都包含有一個(gè)保守的DxxCxxC基序和一個(gè)完整的DUF393結(jié)構(gòu)域(圖6)。說(shuō)明DCC1蛋白在不同物種進(jìn)化過(guò)程中具有一定的保守性。

為進(jìn)一步研究DCC1基因的進(jìn)化關(guān)系，根據(jù)小麥TaDCC1基因的氨基酸序列，在NCBI網(wǎng)站比對(duì)得到其他物種的DCC1基因的氨基酸序列，與小麥TaDCC1氨基酸序列一起用MEGA7.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖7)，可以看出小麥基因TaDCC1-2A與TaDCC1-2B聚為一支，且與烏拉爾圖小麥及二粒小麥同源度相對(duì)較高；而小麥基因TaDCC1-2D與小麥基因TaDCC1-2A及TaDCC1-2B發(fā)生分化，并與粗山羊草聚在一支。這與小麥A基因組來(lái)自于烏拉爾圖小麥，D染色體組來(lái)源于粗山羊草的研究結(jié)果相吻合。進(jìn)化分析表明，普通小麥TaDCC13個(gè)基因拷貝和野生二粒小麥、烏拉爾圖小麥、粗山羊草在進(jìn)化上相對(duì)保守；而與玉米、水稻、短柄草等單子葉作物屬于遺傳較遠(yuǎn)的分支；與擬南芥等雙子葉植物遺傳距離最遠(yuǎn)。普通小麥TaDCC13個(gè)基因拷貝與親緣關(guān)系近的物種間同源性最高，即使親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種間也具有一定的同源性。

橫坐標(biāo)表示編碼蛋白的氨基酸位置順序 The abscissa represents the sequence of amino acid position of coding protein；縱坐標(biāo)代表親水性得分 The vertical axis represents the score of hydrophilicity

圖4 TaDCC1-2B蛋白的親水性分析
Fig.4 Hydrophility analysis of TaDCC1-2B protein

圖5 TaDCC1-2B蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Predicted three-dimensional structure of TaDCC1-2B protein

圖6 TaDCC1與其他物種同源蛋白的多重序列比對(duì)Fig.6 Multi-alignment of TaDCC1 amin oacid sequences with other DCC1s

圖7 小麥與其他物種DCC1蛋白的進(jìn)化分析Fig.7 Phylogene trees of DCC1 proteins from wheat and other species

2.4 啟動(dòng)子區(qū)域分析

啟動(dòng)子分析結(jié)果表明(表3)：?jiǎn)?dòng)子序列中含有大量與啟動(dòng)子增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率相關(guān)TATA-box和CAAT-box啟動(dòng)子基本元件，此外還含有許多參與光響應(yīng)、茉莉酸甲酯應(yīng)答以及功能未知的順式作用調(diào)節(jié)元件。從響應(yīng)植物激素的順式作用元件來(lái)看，推測(cè)該基因可與赤霉素信號(hào)調(diào)節(jié)有關(guān)，同時(shí)也預(yù)測(cè)該基因啟動(dòng)子參與分生組織的 表達(dá)。

2.5 轉(zhuǎn) TaDCC1-2B基因擬南芥植株的篩選及鑒定

為了研究TaDCC1-2B基因的功能，將過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥突變體dcc1，對(duì)收獲的轉(zhuǎn)基因T0代種子繼續(xù)種植、篩選及鑒定(圖8)，得到轉(zhuǎn)基因T3代株系并收獲種子，用于后續(xù)試驗(yàn)。

M.D2000 Marker；1.陰性對(duì)照 Negative control；2.陽(yáng)性對(duì)照 Positive control；3-5.轉(zhuǎn)基因擬南芥 TransgenicArabidopsis

圖8 轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定
Fig.8 PCR detection of transgenicArabidopsisthaliana

2.6 TaDCC1-2B基因以及WUS基因的表達(dá)分析

為了檢測(cè)TaDCC1-2B基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)水平，提取轉(zhuǎn)基因T3代在SIM培養(yǎng)25 d的再生芽RNA，以TUB2為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)。結(jié)果顯示(圖9)轉(zhuǎn)基因T3代株系的再生芽中TaDCC1-2B基因呈現(xiàn)較高的表達(dá)量水平。同時(shí)，采取同樣的方法對(duì)Col-0、dcc1和T3代轉(zhuǎn)基因株系的再生芽標(biāo)記基因WUS的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明(圖10)Col及T3的WUS表達(dá)量極顯著高于dcc1(P< 0.01)，且T3的WUS表達(dá)量接近于Col-0。

2.7 轉(zhuǎn) TaDCC1-2B基因擬南芥表型鑒定

由圖11觀(guān)察到轉(zhuǎn)基因株系再生芽表型得到了一定程度的恢復(fù)，接近于野生型。統(tǒng)計(jì) Col-0、dcc1、T3代株系根尖誘導(dǎo)的愈傷組織在SIM培養(yǎng)第25天的芽再生率(圖12)，dcc1只有31.3%，而野生型Col-0 的芽再生率達(dá)到86.7%，顯著高于dcc1(P<0.01)，轉(zhuǎn)基因T3代植株的芽再生能力達(dá)到57.6%，顯著高于dcc1(P<0.05)。

圖9 TaDCC1-2B基因表達(dá)分析Fig.9 Quantitative real time analysis of TaDCC1-2B expression

不同字母表示在0.05水平上顯著：下同 Different letters indicate significant differencesat the 0.05 level;The same below.

圖10WUS基因表達(dá)分析
Fig.10 Quantitative real time analysis
ofWUSexpression

圖11 在SIM培養(yǎng)第25天的再生芽Fig.11 The regeneration buds cultured in SIM medium for 25 days

圖12 芽再生頻率統(tǒng)計(jì)分析Fig.12 Statistical analysis of shoot regeneration frequencies

3 討 論

目前，在多種植物中已發(fā)現(xiàn)和克隆了許多對(duì)體外培養(yǎng)再生過(guò)程有重要影響的基因，并通過(guò)在模式物種中的研究，確定了這些候選基因的功能，并對(duì)目標(biāo)物種進(jìn)行轉(zhuǎn)基因從而提高這些物種的再生能力[2]。小麥?zhǔn)侵袊?guó)第三大糧食作物，但在提高小麥體外再生能力的研究上，尚處于對(duì)體外再生培養(yǎng)方法的優(yōu)化和控制再生性狀基因的QTL定位上[37]。普通小麥?zhǔn)且粋€(gè)異源六倍體物種，基因組龐大且復(fù)雜，由A、B、D 3個(gè)序列高度同源的亞基因組組成[38]。本研究用擬南芥硫氧還蛋白DCC1基因同源克隆到小麥中3條高度同源基因序列，通過(guò)檢測(cè)TaDCC1基因在小麥組織中的的表達(dá)量分析3個(gè)拷貝基因表達(dá)量未表現(xiàn)出顯著差異(圖3)，說(shuō)明3個(gè)基因功能相對(duì)保守。由于TaDCC1-2B基因氨基酸序列與擬南芥硫氧還蛋白DCC1同源度最高，因此選取TaDCC1-2B目的基因作為研究對(duì)象。通過(guò)對(duì)TaDCC1-2B基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)TaDCC1-2B蛋白N端的DxxCxxC基序中具有2個(gè)Cys殘基，推測(cè)此蛋白具有調(diào)節(jié)硫醇-二硫鍵交換方面的功能，這與前人報(bào)道的擬南芥DCC1蛋白結(jié)構(gòu)相似[39-40]。通過(guò)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)該蛋白與粗山羊草、烏拉爾圖小麥、野生二粒小麥、大麥等單子葉植物的DCC1蛋白同源性較高，但與模式植物擬南芥相比，同源性相對(duì)較低，說(shuō)明二者蛋白之間差異較大，推測(cè)它們?cè)诠δ苌弦部赡芤虼舜嬖诓町悾枰M(jìn)一步鑒定TaDCC1-2B基因的再生功能。

硫氧還蛋白作為抗氧化系統(tǒng)的新型抗氧化酶，在線(xiàn)粒體抵抗氧化脅迫過(guò)程中起關(guān)鍵作用[41-42]。在大麥中轉(zhuǎn)入外源硫氧還蛋白基因可提高大麥的抗氧化酶活性，對(duì)清除多余的ROS具有積極作用[43]。已有研究報(bào)道擬南芥硫氧還蛋白DCC1通過(guò)氧化還原修飾調(diào)節(jié)愈傷組織線(xiàn)粒體內(nèi)ROS的穩(wěn)態(tài)從而調(diào)控植物再生[34]，這預(yù)示著TaDCC1-2B基因在小麥再生能力方面可能也起著相似的作用。鑒于小麥的遺傳轉(zhuǎn)化周期較長(zhǎng)，本研究首先利用模式植物擬南芥對(duì)TaDCC1-2B基因的功能進(jìn)行了初步研究。在擬南芥突變體 dcc1中過(guò)量表達(dá)小麥TaDCC1-2B基因后，轉(zhuǎn)基因株系T3代中TaDCC1-2B基因的表達(dá)水平顯著高于Col-0和dcc1植株(圖9)。此外，通過(guò)組織培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因T3植株的再生性狀得到一定恢復(fù)(圖11)。Col-0和轉(zhuǎn)基因T3芽的再生率相對(duì)dcc1分別達(dá)到極顯著(P<0.01)和顯著水平(P<0.05)(圖12)，表明TaDCC1-2B基因在擬南芥根尖再生成芽的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

基因WUS是WOX轉(zhuǎn)錄因子家族中研究最為清楚地一個(gè)基因，該基因在擬南芥莖頂端分生組織中特異表達(dá)，負(fù)責(zé)調(diào)控莖端分生組織干細(xì)胞的形成和維持，并通過(guò)與CLV3基因形成一個(gè)反饋調(diào)節(jié)環(huán)來(lái)調(diào)控莖頂端分生組織中器官的啟動(dòng)與分生細(xì)胞的維持[44]，因此WUS可作為再生芽的標(biāo)記基因。對(duì)比在SIM培養(yǎng)25 d的再生芽體內(nèi)WUS基因的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，WUS的表達(dá)量在Col-0 和T3體內(nèi)顯著高于dcc1，在Col-0 和T3兩者之間差異不顯著(圖10)。研究報(bào)道擬南芥硫氧還蛋白DCC1的突變會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體內(nèi)ROS含量增加，激增的ROS導(dǎo)致愈傷組織和芽分生組織形成的主基因表達(dá)受到抑制，而將擬南芥DCC1過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入突變體中，其再生率顯著提高，接近野生型再生水平[34]。因此推測(cè)試驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因T3株系由于TaDCC1-2B基因的過(guò)量表達(dá)，使ROS水平保持穩(wěn)態(tài)，WUS基因得以正常表達(dá)，從而保持了正常的再生能力。

本研究通過(guò)同源克隆得到一個(gè)小麥硫氧還蛋白基因TaDCC1-2B，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和初步的功能驗(yàn)證，結(jié)果表明TaDCC1-2B基因能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的再生能力。同時(shí)應(yīng)注意到，小麥遺傳背景復(fù)雜，調(diào)控體外體細(xì)胞胚胎發(fā)生的主效基因可能不同，從與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的擬南芥中克隆的再生基因并不一定能提高小麥的再生能力，需要對(duì)其在小麥組織培養(yǎng)實(shí)踐中進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究用同源克隆的方法從小麥品種‘中國(guó)春’中克隆得到一個(gè)小麥硫氧還蛋白基因TaDCC1-2B，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和初步的功能驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因含645 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼214個(gè)氨基酸，氨基酸序列存在一個(gè)包含DxxCxxC基序的DUF393結(jié)構(gòu)域，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明發(fā)該基因具有較強(qiáng)的保守性。另外，將TaDCC1-2B基因轉(zhuǎn)入擬南芥突變體dcc1中，獲得的轉(zhuǎn)基因株系的再生能力得到顯著提高，接近恢復(fù)到野生型水平，表明該基因在擬南芥根尖再生成芽的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，可能在小麥的再生過(guò)程中也將發(fā)揮相似作用。