常永芳，包鵬甲，張永峰，付東海，吳曉云，褚 敏，閻 萍，

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省牦牛繁育工程重點實驗室，蘭州 730050)

牦牛是生活在高寒低氧地區(qū)、具有重要文化和生產(chǎn)意義的放牧動物，是高原上的生命之舟。其毛、肉、奶等副產(chǎn)品為藏牧民提供了有效的生活保障和經(jīng)濟(jì)來源[1]。天祝白牦牛產(chǎn)自甘肅省天祝藏族自治縣，是中國乃至世界的珍稀牦牛種質(zhì)資源，其被毛純白、厚密，頸部、肩部、背部多絨毛，體側(cè)部多長毛并與尾毛共同形成裙毛[1-2]，兼具利用價值和觀賞價值[2]。它的皮毛不僅具有抵御環(huán)境侵害(寒冷、強(qiáng)輻射和沙塵暴)、感覺、新陳代謝和調(diào)節(jié)體溫的作用，而且是制革和襯墊織物的高級原材料。毛囊是產(chǎn)生毛發(fā)的基本單位，由上皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞之間相互作用形成。哺乳動物毛囊生長具有周期性，循環(huán)一般經(jīng)歷生長期、退行期和休止期。但受環(huán)境、季節(jié)以及個體差異影響，不同物種間毛囊生長周期存在一定差異，如內(nèi)蒙古絨山羊次級毛囊5-12月為生長期，1月份進(jìn)入退行期，2-4月份為休止期；而兔子毛囊生長期經(jīng)歷兩輪，分別在每年1-4月和9-12月；藏綿羊毛囊生長期處于5-8月，11月份進(jìn)入退行期，2月處于休止期[3-6]。毛囊的周期性活動伴隨著毛纖維的新生與脫落，且毛囊的這種循環(huán)生長受眾多生長促進(jìn)和抑制因子之間嚴(yán)格控制的平衡調(diào)節(jié)[7-10]。因此，研究毛囊發(fā)育和周期性生長活動中的調(diào)控因子對改善牦牛毛品質(zhì)和產(chǎn)量具有重要意義。

胰島素樣生長因子(IGF)，是一種具有與胰島素相似結(jié)構(gòu)的同源單鏈多肽，通常與胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)相結(jié)合，以復(fù)合物的形式存在于機(jī)體組織或血液中。IGF包括IGF-1和IGF-2，均是由肝臟響應(yīng)垂體分泌的生長激素(GH)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。IGF-1作為一種內(nèi)分泌激素，負(fù)責(zé)機(jī)體組織的生長和發(fā)育，例如肌肉、骨骼、腎臟、皮膚、肺和肝臟等，同時IGF-1作為一個強(qiáng)勁的有絲分裂原，可促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖、分化，同時可抑制細(xì)胞凋亡[11]。研究表明[12-13]，IGF-1可通過刺激毛囊的表皮和真皮成分，促進(jìn)毛囊代謝，增加產(chǎn)毛量等。其受體IGF-1R大量存在于動物皮膚毛囊的毛球和外根鞘中，在間充質(zhì)細(xì)胞和表皮細(xì)胞中表達(dá)[11,14]。IGF-1通過與其受體(IGF-1R)相互作用來調(diào)節(jié)毛囊的生長周期，并刺激毛母質(zhì)和毛乳頭細(xì)胞的增殖和分化，同時抑制細(xì)胞的凋亡，對維持毛囊的生長周期至關(guān)重要[15-16]。研究表明，沉默與過表達(dá)IGF-1基因都會影響毛囊的發(fā)生及形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，外源性IGF-1會加快角質(zhì)細(xì)胞增殖，可有效促進(jìn)體外培養(yǎng)毛囊的生長[17-18]。魏玉青[12]研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1能夠通過調(diào)節(jié)IGF-1家族基因的表達(dá)來促進(jìn)絨山羊毛囊發(fā)育并維持其毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)。此外，IGF-1基因還可促進(jìn)白鵝次級毛囊的發(fā)育[19]；Trueb等[20]研究表明，IGF-1影響毛囊增殖、頭發(fā)生長周期以及毛囊分化，對人頭發(fā)的生長和防止脫發(fā)具有重要作用。目前，IGF-1對牦牛毛囊發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制尚不明確，其在物種進(jìn)化過程中相對保守，但也存在一定的種間差異。因此，本研究以天祝白牦牛皮膚組織為試驗材料，克隆天祝白牦牛IGF-1基因序列，分析其分子結(jié)構(gòu)及功能，并探究IGF-1基因在天祝白牦牛毛囊發(fā)育不同時期的表達(dá)特征，以期為該因子對毛囊發(fā)育和毛發(fā)纖維生長的調(diào)控及其功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白牦牛均來自于甘肅省天?？h白牦牛養(yǎng)殖場，選取同一養(yǎng)殖場年齡相近(2～3歲)、飼養(yǎng)條件相同且相互之間無遺傳相關(guān)的3頭雌性空懷天祝白牦牛，分別在1、3、10月份采集這3頭牦牛的體側(cè)皮膚組織，用生理鹽水和PBS處理組織樣品表面異物，分裝標(biāo)記并迅速投入液氮罐中，備用。

1.2 試驗試劑

DNA純化試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、pMD 19-T克隆載體、DL 2 000DNA marker、2×TaqPCR Master Mix、膠回收試劑盒，均購自TaKaRa公司；Amp(氨芐青霉素)、Trizol均購自Solarbio公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA提取及cDNA合成 通過TrizoI法提取皮膚組織總RNA，并通過NanoDrop儀器檢測RNA的質(zhì)量濃度和純度，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。以皮膚組織RNA為模板，使用TakaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成， -20 ℃保存，備用。

1.3.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中黃牛IGF-1基因mRNA序列 (登錄號: NM_001077828.1) ，利用NCBI在線工具Pick Primer設(shè)計引物，詳見表1。

1.3.3 目的片段的TA克隆與測序 以天祝白牦牛皮膚組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物見表1，總反應(yīng)體系20 μL：上下游引物各1 μL(10 μmo/L)，cDNA 1 μL， RNase-Free ddH2O 7 μL，2×TaqPCR Master Mix 10 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存；用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物?；厥漳康钠?，將適量PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T克隆載體(16 ℃，30 min)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取白色陽性單克隆菌落至LB (Amp+)液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)(37 ℃)，最后進(jìn)行菌液PCR鑒定，選擇 PCR鑒定正確的陽性單克隆送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行 測序。

1.3.4 生物信息學(xué)分析 利用ORF Finder在線程序?qū)Π钻笈GF-1基因序列進(jìn)行開放閱讀框分析，并用BLAST進(jìn)行序列同源性比對分析；使用ExPASy中的在線工具ProtParam和ProtScale分別分析IGF-1氨基酸序列的理化性質(zhì)和親疏水性；使用ExPASy中的SOPMA、SWISS-MODEL工具預(yù)測IGF-1蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)；使用SignalP 4.1和TMHMM在線工具預(yù)測牦牛IGF-1蛋白的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)；利用SMART和PSORT Ⅱ Prediction分析IGF-1蛋白的結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位；利用Mega 7.0軟件構(gòu)建IGF-1基因的系統(tǒng)生物進(jìn)化樹[21]。

表1 IGF-1基因引物序列Table 1 Primer sequences of IGF-1 gene

1.3.5 qRT-PCR技術(shù)檢測IGF-1基因的相對表達(dá)量 以皮膚組織的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系(總體積為20 μL)：SYBRGreenⅡ 10 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，模板cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸5 s，共39個循環(huán)。每個樣品3個重復(fù)，以GAPDH為內(nèi)參基因。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 利用2-△△Ct法計算毛囊發(fā)育3個時期的相對表達(dá)量，并使用SPSS 22.0軟件對IGF-1基因在牦牛毛囊發(fā)育不同時期的表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 IGF-1基因PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果

如圖1 所示，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰明亮，特異性良好，且擴(kuò)增片段的大小與預(yù)期一致。

1～2.IGF-1基因PCR產(chǎn)物 PCR products ofIGF-1gene；M.DL2000 DNA marker

圖1IGF-1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測
Fig.1 The electrophoresis of PCR
amplification products ofIGF-1gene

2.2 IGF-1基因克隆測序與序列分析

將克隆測序得到的序列與GenBank上黃牛IGF-1基因(NM_001077828.1)序列比對發(fā)現(xiàn)，第316位存在一個堿基差異(T→C)，為同義突變。序列分析表明，該序列包含一個長度為465 bp的完整開放閱讀框(圖2)，編碼154個氨基酸；76 bp處為起始密碼子(ATG)，540 bp處為終止密碼子(TAG)，堿基組成為A=22.58%、G= 28.60%、T=21.29%、C=27.53%，C+G (56.13%)高于A+T(43.87%)，說明IGF-1基因編碼區(qū)的DNA雙鏈比較穩(wěn)定。

圖2 IGF-1基因開放閱讀框分析Fig.2 The open reading frame analysis of IGF-1 gene

2.3 IGF-1蛋白基本理化性質(zhì)分析

基本理化性質(zhì)分析表明，天祝白牦牛IGF-1蛋白分子式為C744H1186N214O216S15，分子質(zhì)量為17 065.81 ku，理論等電點為9.36；含20種氨基酸(表2)，其中亮氨酸Leu (9.7%)、丙氨酸Ala (9.7%)的頻率最高，其水溶液在280 nm處的消光系數(shù)為8 075，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為55.06，屬于不穩(wěn)定蛋白。親/疏水性預(yù)測結(jié)果顯示(圖3)，該基因編碼的蛋白質(zhì)疏水性最大值為 2.756(第37位)，最小值為-1.978(第127位)，總平均親水性為-0.249，為親水性蛋白。

2.4 IGF-1蛋白信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

天祝白牦牛IGF-1蛋白信號肽預(yù)測分析結(jié)果如圖4所示 ，Y-max為0.671、C-max為0.631、S-max為0.903，均大于閾值0.5，表明該蛋白存在信號肽區(qū)域，為分泌蛋白，氨基酸序列在1～49區(qū)域的S值較高，預(yù)測為信號肽區(qū)域；IGF-1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖5所示，該蛋白存在一個跨膜結(jié)構(gòu)。

表2 IGF-1編碼蛋白中氨基酸的含量Table 2 Amino acid content of protein encoded by IGF-1 gene %

正值表示疏水，負(fù)值表示親水 Positive values indicate hydrophobic and negative values indicate hydrophilic

圖3 白牦牛IGF-1蛋白水親/疏水性預(yù)測
Fig.3 Prediction of hydrophilicity/hy
drophobicity of white yak IGF-1 protein

圖4 白牦牛IGF-1蛋白信號肽預(yù)測Fig.4 Prediction of signal peptide of white yak IGF-1 protein

圖5 白牦牛IGF-1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Prediction of transmembrane structure of white yak IGF-1 protein

2.5 IGF-1蛋白二、三級結(jié)構(gòu)分析

天祝白牦牛IGF-1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，主要由α-螺旋(27.27%)、β-轉(zhuǎn)角(3.25%)、無規(guī)則卷曲(57.79 %)和11.69%的延伸鏈組成(圖6)；三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致(圖7)。三級結(jié)構(gòu)以3Iri.1.A為模板，序列相似度為87.34%，符合同源建模法中序列相似度大于35%的要求。

圖中豎線按照由長到短遞減依次表示α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲 The vertical lines in the graph according to descending order indicated alpha helix,extended strand,beta turn and random coil,respectively

圖6 白牦牛IGF-1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測
Fig.6 Prediction of secondary structure of white yak IGF-1 protein

圖7 IGF-1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Prediction of tertiary structure of white yak IGF-1 protein

2.6 IGF-1蛋白結(jié)構(gòu)域及亞細(xì)胞定位分析

天祝白牦牛IGF-1蛋白包含一個結(jié)構(gòu)域，第52(Glu)至第110(Cys)位氨基酸為Insulin / insulin-like growth factor / relaxin family( IIGF)家族典型的保守結(jié)構(gòu)功能域(圖8)；IGF-1亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明：IGF-1蛋白在細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞外、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、分泌系統(tǒng)囊泡中分別占65.2%、17.4%、4.3%、4.3%、4.3%和4.3%，在細(xì)胞核中分布最多。

2.7 IGF-1基因同源性分析

利用MEGA 7.0軟件對天祝白牦牛、黃牛、梅花鹿、馬鹿、山羊、綿羊、野豬、倉鼠、田鼠、鼠兔等物種的IGF-1氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖9) 。結(jié)果顯示：天祝白牦牛與黃牛親緣關(guān)系最近，同源性為100%；其他依次為綿羊98%、梅花鹿98%、馬鹿97%、野豬97%、山羊96%、倉鼠92%、田鼠90%、鼠兔90%，表明IGF-1基因在哺乳動物進(jìn)化過程中比較保守。

圖8 白牦牛IGF-1蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.8 Protein domains of white yak IGF-1

圖9 IGF-1基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree of IGF-1 gene

2.8 qRT-PCR技術(shù)檢測 IGF-1基因相對表達(dá)量

qRT-PCR技術(shù)檢測IGF-1基因在牦牛毛囊發(fā)育不同時期的表達(dá)水平，結(jié)果表明(圖10)，在3 個時期均能檢測到IGF-1基因的表達(dá)，并且在生長期表達(dá)量最高，休止期表達(dá)量最低，生長期和退行期的表達(dá)量顯著高于休止期(P<0.05)，退行期表達(dá)量與生長期無顯著差異(P>0.05)。

上標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05) Different letter on the bar indicates statistical difference(P<0.05)

圖10 毛囊發(fā)育周中期皮膚組織
IGF-1基因的mRNA表達(dá)水平
Fig.10 mRNA expression level ofIGF-1
in the skin of during hair cycle

3 討 論

本研究通過克隆白牦牛IGF-1基因CDS區(qū)，分析其序列特征，探究IGF-1基因在毛囊周期性發(fā)育中的功能。將獲得的天祝白牦牛IGF-1基因的編碼區(qū)序列與黃牛的序列比對，發(fā)現(xiàn)第316位發(fā)生1個堿基突變(TAT→TAC)，為同義突變。以往基因同義突變被認(rèn)為不會引起功能性的變化，但近年來研究發(fā)現(xiàn)在密碼子高度保守的區(qū)域內(nèi)存在一種同義突變，影響基因表達(dá)、翻譯效率或蛋白質(zhì)折疊速率及蛋白質(zhì)構(gòu)象，甚至是蛋白質(zhì)功能[22]。對IGF-1氨基酸序列預(yù)測顯示，其編碼154個氨基酸，是不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；賈浩等[23]研究表明，蛋白質(zhì)的半衰期與其穩(wěn)定性呈正相關(guān)，而在本研究中IGF-1蛋白半衰期較長為30 h，卻不是穩(wěn)定性蛋白，這一研究結(jié)果與賈浩等[23]的研究報道不符，天祝白牦牛IGF-1基因出現(xiàn)這種不一致的特性，可能與其特殊的作用方式及與IGFS家族內(nèi)相關(guān)受體作用有關(guān)，需進(jìn)一步研究和探討。各物種氨基酸序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，天祝白牦牛與黃牛IGF-1氨基酸序列同源性為100%，相似度最高，不同物種之間IGF-1基因存在較高保守性，這意味著該基因在人、小鼠、絨山羊、牦牛等多種哺乳動物皮膚毛囊中的作用具有相似性；天祝白牦牛IGF-1蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白在第52～110位氨基酸含有一個Insulin / insulin-like growth factor / relaxin family( IIGF)家族典型的保守結(jié)構(gòu)功能域，為該基因功能的深入研究提供理論參考。

毛發(fā)的生長主要受毛囊和其他表皮細(xì)胞間的相互作用影響，毛囊周期性循環(huán)過程中毛囊細(xì)胞的激活以及新舊毛干的交替受多個生長因子和信號通路的共同調(diào)控。IGF-1通過與其受體結(jié)合促進(jìn) IGF-1R 酪氨酸殘基磷酸化，也可通過MAPK、ERK1/2信號通路，激活I(lǐng)GF-1的生物學(xué)效應(yīng)，從而觸發(fā)下游反應(yīng)，最終刺激細(xì)胞分裂，調(diào)控動物的生長發(fā)育[24-26]。研究IGF-1基因在天祝白牦牛皮膚組織中的表達(dá)趨勢發(fā)現(xiàn)，該基因在毛囊發(fā)育不同時期均有表達(dá)，但毛囊發(fā)育生長期IGF-1表達(dá)量顯著高于休止期，這與魏玉青[12]和劉逍等[19]的研究結(jié)果基本一致。由于生長期毛囊生長處于最活躍的狀態(tài)，此時毛乳頭持續(xù)增大且毛囊隆突部的干細(xì)胞迅速增殖，毛母質(zhì)細(xì)胞的增殖分化能力不斷增強(qiáng)，使得毛囊和毛干不斷生長[27-28]，推測IGF-1可能在毛囊生長期刺激毛囊增殖分化中發(fā)揮重要作用。此外，IGF-1能夠通過激活RNA聚合酶等活性，來促進(jìn)非組蛋白的磷酸化，同時增加mRNA水平[29]。近年來研究發(fā)現(xiàn)在毛囊發(fā)育過程中IGF-1被認(rèn)為具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移的作用，需通過與特定的細(xì)胞表面受體結(jié)合來激活細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)作用[24,30]，同時IGF-1在許多細(xì)胞類型中被認(rèn)為是一種抗凋亡的生存因子，可能在毛囊周期的生長期抑制細(xì)胞調(diào)亡，從而維持毛囊生長期[31]。由此推斷IGF-1基因可能通過刺激毛囊細(xì)胞的生長活動參與調(diào)控白牦牛毛囊發(fā)育及其周期性變化。由于毛囊的周期性活動是由眾多生長促進(jìn)和抑制因子之間嚴(yán)格控制的平衡和相互作用來調(diào)節(jié)的，是一個復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，因此IGF-1自身以及與其他因子的相互作用對哺乳動物毛囊發(fā)育及其毛發(fā)生長的調(diào)控機(jī)理還需進(jìn)一步探索。

4 結(jié) 論

通過RT-PCR技術(shù)成功克隆天祝白牦牛IGF-1基因CDS序列，并研究發(fā)現(xiàn)IGF-1基因在白牦牛毛囊發(fā)育不同時期皮膚組織中呈規(guī)律性表達(dá)。表明IGF-1基因參與調(diào)控白牦牛毛囊的生長及毛囊的周期性循環(huán)，為解析白牦牛毛囊發(fā)育及被毛生長提供理論依據(jù)，同時也為研究IGF-1基因在白牦牛毛囊生長發(fā)育中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。