滑留帥，白躍宇，王 璟，陳付英，張子敬，王風(fēng)勤，徐照學(xué)，王二耀

(1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，鄭州 450002；2. 河南省種牛遺傳性能測定中心，鄭州 450046；3. 科爾沁牛業(yè)南陽有限公司，河南南陽 473555)

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNPs)是指由DNA序列中某個特定位點上單個核苷酸發(fā)生變異(轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失)而引起的序列多態(tài)性。與其他分子標(biāo)記相比，SNPs具有分布廣、密度高、遺傳穩(wěn)定、易于自動化檢測等特點，成為繼限制性片段長度多態(tài)性和微衛(wèi)星多態(tài)性這兩代遺傳標(biāo)記后的第三代遺傳標(biāo)記[1-2]。目前世界上關(guān)于SNPs的研究數(shù)據(jù)增長迅速，相關(guān)研究對于疾病高危群體預(yù)測、疾病相關(guān)基因鑒定、藥物設(shè)計和測試、生物起源進化、生物多樣性評價、動植物遺傳標(biāo)記、品種改良等許多生命科學(xué)領(lǐng)域問題都起到重要的推動作用。

高分辨率熔解(High-resolution melting, HRM)技術(shù)，是近幾年來新興起的一種SNPs檢測方法。由于使用新型的飽和染料和高分辨率的儀器，HRM通過PCR之后的高分辨率熔解曲線分析，能夠檢測PCR片段中的單個堿基差異，因而可用于高通量的突變掃描、基因分型和甲基化分析等[3-4]。由于該技術(shù)僅在標(biāo)準(zhǔn)PCR的基礎(chǔ)上添加飽和熒光染料而無需使用序列特異性探針，同時在PCR結(jié)束后直接運行高分辨率熔解曲線而無須電泳，從而具有操作簡便、快速、準(zhǔn)確、通量高、成本低等特點，并且實現(xiàn)了真正的閉管操作，目前受到廣泛關(guān)注[4-5]。

雙肌性狀是指肌肉中肌纖維增多、全身肌肉總量顯著增加而形成的一種表型。動物雙肌性狀首先在牛中發(fā)現(xiàn)，雙肌牛的最顯著特征是肌纖維普遍肥大，可引起牛肌肉質(zhì)量平均增加25%。由于具有顯著的肉用優(yōu)勢，雙肌性狀一直是家畜培育的關(guān)注熱點。肌肉生長抑制素(Myostatin,MSTN)基因功能異常是導(dǎo)致動物雙肌性狀的遺傳基礎(chǔ)[6-9]。目前在牛的MSTN基因上共發(fā)現(xiàn)了6個自然發(fā)生的功能缺陷型突變，其中C313Y是在MSTN基因編碼區(qū)第938位核苷酸發(fā)生G到A的突變，從而引起第313位氨基酸由半胱氨酸(C)轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼?Y)，進而引起蛋白質(zhì)失活，是皮埃蒙特牛的雙肌遺傳基礎(chǔ)[6-8]。皮南牛是在河南省南陽市新野縣以南陽牛為母本，以皮埃蒙特牛為父本，通過導(dǎo)入雜交、級進雜交和橫交固定等多個階段選育而來的高檔肉牛新品系[10]。皮南牛具有優(yōu)秀的肉用性能，包括生長速度快、肉質(zhì)好、屠宰率高、高檔牛肉切塊率高等特點，因此深受市場歡迎。皮南牛作為皮埃蒙特牛的雜交牛，也部分繼承了皮南牛的雙肌性狀。

本研究擬利用HRM建立一種MSTN基因C313Y突變的快速檢測方法，進而分析目前皮南牛群體中MSTNC313Y突變的頻率，以及突變對皮南牛生產(chǎn)性能的影響。研究結(jié)果對快速組建雙肌皮南牛核心群，加強皮南牛的整體選育，進而促進中國肉牛產(chǎn)業(yè)的種質(zhì)創(chuàng)新具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采自河南省南陽市新野縣。使用φ=70%酒精清潔皮南牛(母牛)的耳緣部位后，用耳缺鉗采集0.3 cm3大小的耳緣組織樣品。將樣品用PBS清洗后，至于組織樣品保存液中帶回實驗室，-80 ℃保存。

1.2 體尺測量和體質(zhì)量估計

采集組織樣品的同時，測量體高、體斜長、胸圍、尻寬和尻長等體尺指標(biāo)，并根據(jù)公式“體質(zhì) 量=體斜長×胸圍2/10 800”估算體質(zhì)量[2, 11]。

1.3 主要試劑

組織樣品保存液(No. 9750，TaKaRa，大連寶生物)，φ=70%酒精，PBS緩沖液，組織樣品基因組DNA提取試劑盒(No. DP304，天根，北京)，普通PCR試劑盒(No. KT221，天根，北京)，HRM PCR試劑盒(No. FP210，天根，北京)。

1.4 主要儀器

離心機，瓊脂糖凝膠電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，紫外分光光度計(NanoDrop，美國)，普通PCR儀(Eppendorf，德國)，熒光定量PCR儀(Light Cycler 96，羅氏，瑞士)。

1.5 基因組DNA的提取

使用組織樣品DNA提取試劑盒提取樣品中的基因組DNA，操作步驟參照試劑盒說明書。DNA提取后，使用紫外分光光度計檢測DNA的質(zhì)量濃度和純度，并進一步稀釋至50 ng/μL。

1.6 利用測序技術(shù)對樣品MSTN基因C313Y位點分型

利用PCR擴增所有樣品的MSTN基因(GenBank登錄號:NM_001001525.3)C313Y位點。引物序列為C313Y-F：CTAACTGTGGATTTTGAA，C313Y-R：TATAGCATATTAATTGGAGAC。PCR產(chǎn)物長度為200 bp，退火溫度為60 ℃。PCR產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，然后根據(jù)測序結(jié)果對MSTN基因C313Y位點進行分型。

1.7 利用HRM技術(shù)對樣品MSTN基因C313Y位點分型

使用HRM分型的引物為BT-C313Y-F：TTGGATGGGATTGGATTAT，BT-C313Y-R：CACAAGATGGGTATGAGGA。PCR產(chǎn)物長度為104 bp。PCR反應(yīng)體系參照試劑盒說明書，其中20 μL的反應(yīng)體系包含2×HRM analysis premix 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL、基因組DNA(50 ng/μL)1 μL。PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備完成后，置于熒光定量PCR儀中進行HRM分型，PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性2 min，40個循環(huán)(95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸 30 s)，最后添加1次熔解曲線分析。

1.8 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計不同年齡段皮南牛體尺和體質(zhì)量指標(biāo)的均值。

利用一般線性模型(LSM)關(guān)聯(lián)分析MSTN基因C313Y位點對體尺和體質(zhì)量指標(biāo)的影響，公式如下[12-13]：

Y=μ+ age + gene +e

其中Y為個體的表型值，μ為群體均值，age為年齡效應(yīng)，gene為MSTN C313Y的基因型效應(yīng)，e為隨機誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 皮南牛的體尺和體質(zhì)量指標(biāo)統(tǒng)計結(jié)果

共測定99頭皮南牛的體尺指標(biāo)，個體年齡從1歲～6歲不等。結(jié)果表明，3歲前屬于皮南牛的快速生長期，其中1歲平均體質(zhì)量為(283.04±21.41) kg，3歲平均體質(zhì)量為(444.29±56.57) kg。皮南牛在3歲之后體尺和體質(zhì)量指標(biāo)均趨于穩(wěn)定，平均體高、體斜長、胸圍、尻寬、尻長和體質(zhì)量分別是(127.88± 3.65) cm、(154.10± 6.89) cm、(181.48±8.54) cm、(46.19±2.94) cm、(50.52±2.65) cm和(471.34±53.78) kg(表1)。

表1 皮南牛的體尺和體質(zhì)量Table 1 Body measurements and body masses of Pinan cattle

注：數(shù)值為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

Note:the values were displayed as “Mean ± SD”.

2.2 樣品的測序分型結(jié)果

利用Sanger測序的方法對皮南牛MSTN基因C313Y位點進行分型(圖1)，其中純合子個體測序結(jié)果為單峰，而雜合子個體測序結(jié)果為雙峰。分型結(jié)果表明，GG型個體8個(8.08%)，GA型個體70個(70.7%)，AA型個體21個(21.21%)。

方框內(nèi)展示的是C313Y突變位點，GG型和AA型均為純合子，因此僅有一個獨立的峰，而GA型雜合子有一個雙峰，且該雙峰的高度通常情況下為相鄰峰高的一半左右 The C313Y locus is shown in the box, in which, the genotype GG and AA are homozygous, so there is only one independent peak, while the genotype GA is heterozygous, so there is a double peak and normally, the height of the double peak is just half of the height of the adjacent peaks

圖1 皮南牛MSTN基因C313Y位點的測序分型示意圖
Fig.1 Genotyping ofMSTNC313Y in Pinan cattle by Sanger sequencing

2.3 樣品的HRM分型結(jié)果

利用HRM法對所有個體進行再次分型，分型結(jié)果見圖2。不同的基因型具有不同的熔解曲線模式，其中GG型和AA型均為單峰，但出現(xiàn)的溫度不同，GA型為雙峰且峰高低于GG型和AA型，依據(jù)此熔解曲線模式可以簡單快速地對個體進行分型。分型結(jié)果表明，GG型個體8個，GA型個體70個，AA型個體21個，與Sanger測序結(jié)果完全一致。

X軸是溫度，Y軸為熒光強度對溫度的負(fù)一階導(dǎo)數(shù)(-dF/dT)。其中GG型和AA型個體均為單峰，且AA型個體的峰出現(xiàn)較早(左側(cè))，而GG型個體的峰出現(xiàn)較晚(右側(cè))。GA型個體為雙峰，且峰高低于GG型和AA型 The X-axis is the temperature and the Y-axis is the negative first derivative of the fluorescence intensity versus temperature (-dF/dT). The GG genotype and AA genotype are all single peaks, and the peak of the AA genotype appears earlier (left side) than the GG genotype (right side). The GA genotype has double peaks, and the peak heights are lower than genotype GG and genotype AA

圖2 皮南牛MSTN基因C313Y位點的HRM分型
Fig.2 Genotyping ofMSTNC313Y in Pinan cattle by HRM

2.4 MSTN C313Y突變對生長性狀的影響

利用LSM對MSTN基因C313Y位點的不同基因型與皮南牛體尺和體質(zhì)量指標(biāo)進行關(guān)聯(lián)分析(表2)，結(jié)果表明，雜合型突變(GA)和純和型突變(AA)均能夠顯著提高皮南牛的體尺和體質(zhì)量指標(biāo)，GA型個體的體質(zhì)量比GG型個體提高10.32%(P<0.01)，而AA型個體比GG型個體則提高38.55%(P<0.01)。

表2 皮南牛MSTN基因C313Y位點不同基因型與體尺和體質(zhì)量間的關(guān)聯(lián)分析Table 2 Associations between MSTN C313Y and body measurements and body masses of Pinan cattle

注：數(shù)值為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”。同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:the values were displayed as “Mean ± SE”. In the same column, the difference between values marked with different capital letter was extremely significant (P<0.01), while the different lower letter showed significant difference (P<0.05).

3 討 論

伴隨著關(guān)聯(lián)分析數(shù)據(jù)和功能驗證數(shù)據(jù)的不斷積累，SNPs在動物遺傳育種工作中發(fā)揮著越來越重要的作用。其主要應(yīng)用形式包括以單標(biāo)記為主的標(biāo)記輔助選擇(Marker assisted selection, MAS)和多標(biāo)記為主的全基因組選擇(Genomic selection, GS)。從理論上來講，全基因組選擇包含的遺傳信息更多，選擇也更準(zhǔn)確，是未來分子育種的主要方式[14-15]。但在動物選育生產(chǎn)實踐中，有些經(jīng)濟性狀屬于質(zhì)量性狀，例如毛色[16]、蛋殼顏色[17]、角形[18]等，往往受單基因或單突變控制；有些經(jīng)濟性狀雖然屬于數(shù)量性狀，但存在極顯著的主效基因，或同樣受到單突變的控制，例如產(chǎn)仔數(shù)[19]、肌肉沉積[20]、PSE肉[21]等。這些情況下，利用單標(biāo)記輔助選擇即可實現(xiàn)巨大的遺傳進展，因而不斷優(yōu)化單個SNP的分型方法仍然具有重要的價值。

在育種實踐中，能否開展高通量檢測是一種SNP分型方法能否得到廣泛應(yīng)用的重要影響因素。高通量檢測方法總體上可以分為兩類，第一類是針對同一個樣品并行檢測多個位點，例如芯片、下代測序等技術(shù)，主要應(yīng)用于全基因組選擇。第二類是針對同一個位點并行檢測多個樣品，例如Taqman、KASP、質(zhì)譜等技術(shù)，主要應(yīng)用于單標(biāo)記為主的標(biāo)記輔助選擇。盡管目前已經(jīng)有許多高通量單標(biāo)記分型技術(shù)被開發(fā)和應(yīng)用，但各類方法都有需要繼續(xù)改進的地方，包括成本、步驟、精度、時間等多個方面[1, 22]。高分辨率熔解曲線作為新出現(xiàn)的SNP分型技術(shù)，其擁有許多優(yōu)點，包括無需使用熒光標(biāo)記探針，不受突變種類和突變位點的限制，具有高靈敏度和特異性、高通量、操作簡單靈活、成本低、閉管操作等[4-5]，有望成為重要的第二類高通量檢測技術(shù)。本研究利用HRM對MSTNC313Y突變進行分型，結(jié)果表明與測序分型結(jié)果完全一致，但檢測成本和檢測時間卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于測序分型，進一步證明HRM用于SNP分型的優(yōu)越性。

但是鑒于HRM的分型原理，在實際操作中也有一些需要注意的問題。首先，在檢測的片段內(nèi)最好只存在一個SNP，過多的SNPs往往會造成峰形混亂，進而干擾判型結(jié)果，因此擴增片段長度往往要求小于100 bp。其次，HRM依賴于高精度的熒光定量PCR儀，理想的熔解速度為0.1～0.3 ℃/s，如果設(shè)備精度不能滿足要求則同樣會干擾判型結(jié)果。再次，HRM依賴于飽和熒光染料，因此PCR試劑要求優(yōu)質(zhì)且穩(wěn)定?？傊?，HRM分析結(jié)果依賴于靶點復(fù)雜度、模板純度、高度特異性的HRM PCR試劑盒、高精度的熒光定量PCR儀等多個方面，需要在應(yīng)用時根據(jù)具體情況進行優(yōu)化。

雖然MSTN基因功能失活在家畜中可表現(xiàn)出顯著增加肌肉產(chǎn)量的雙肌性狀，但自然發(fā)生的能夠引起家畜表現(xiàn)雙肌表型的MSTN變異類型非常有限[23-24]，其中藍(lán)白花牛和皮埃蒙特牛是比較典型的代表[6]。利用現(xiàn)有雙肌肉用品種改良本地品種，更是一個十分漫長的過程。在本研究中，MSTNC313Y雜合型突變(GA)和純合型突變(AA)均能夠顯著提高皮南牛的各項體尺和體質(zhì)量指標(biāo)，且純合突變比雜合突變具有更大的提高效果。因此，基于分子標(biāo)記輔助選擇MSTNC313Y純合突變個體，對于皮南牛的綜合選育具有重要的意義。而本研究中開發(fā)的基于HRM技術(shù)對MSTN基因C313Y位點快速分型的方法也具有廣泛的應(yīng)用價值，并且對于其他畜禽的分子標(biāo)記輔助選擇也具有一定的參考價值。

4 結(jié) 論

成功建立基于HRM的皮南牛MSTN基因C313Y位點快速分型方法，該方法對于快速組建皮南牛MSTNC313Y純合突變?nèi)后w，大幅度提高群體的體尺和體質(zhì)量指標(biāo)具有重要應(yīng)用價值。