康天濟(jì)，賈靜麗，田冰，賈永囡，田明，鄭超，劉楊，季宏與

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

心肌缺血是由于心臟冠狀動脈血液灌注減少，心肌細(xì)胞供氧不足，能量代謝失衡，不能維持心肌正常生理機(jī)能而出現(xiàn)的病理狀態(tài)。冠心病是嚴(yán)重危害人類健康的臨床常見病。中藥延胡索具有擴(kuò)張冠脈血管、提高冠脈流量、對心肌缺血、壞死有保護(hù)所用[1]，延胡索總生物堿滴丸是其提取精制濃縮的總生物堿有效部位的制劑。本實(shí)驗(yàn)對延胡索總生物堿滴丸進(jìn)行藥效學(xué)研究，觀察其對實(shí)驗(yàn)犬急性心肌缺血、心肌梗死的保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

比格犬，健康成年，體質(zhì)量12～16 kg，雌雄兼用。由沈陽康平實(shí)驗(yàn)動物研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及儀器

延胡索總生物堿滴丸(規(guī)格：35 mg/粒，每粒含延胡索總生物堿5 mg。自制);復(fù)方丹參滴丸(規(guī)格：每丸重27 mg，批號：Z1095011。天士力制藥集團(tuán)股份有限公司);P11011戊巴比妥納(Pentobarbital sodium sat)(百杰斯生物公司);枸櫞酸鈉(惠氏生化有限公司)EDTA-K2 一次性使用真空采血管2 mL;32% 檸檬酸鈉 一次性真空采血管2 mL;肝素鈉一次性真空采血管5 mL(江蘇康捷醫(yī)療器械有限公司);BL-420生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰萌科技有限公司);AthlonX GLAMOUR2000全自動生化分析儀AMD(美國MD公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥方法

取健康成年的實(shí)驗(yàn)動物比格犬20只，體質(zhì)量均在12～16 kg，隨機(jī)分成5組，每組4只，即(1)模型對照組，(2)延胡索總生物堿滴丸劑高劑量組，(3)延胡索總生物堿滴丸劑中劑量組，(4)延胡索總生物堿滴丸劑低劑量組，(5)丹參滴丸陽性對照組。

模型對照組給予3 mL/kg的生理鹽水，延胡索總生物堿滴丸劑高、中、低劑量組和丹參滴丸陽性對照組的給藥劑量，均按人和狗間體表面積的等效劑量比折算成等效劑量后，按等效劑量的16、8、2、2設(shè)置梯度，即延胡索總生物堿滴丸劑高、中、低劑量組和丹參滴丸陽性組給藥劑量分別為：222.0 mg/kg、111.9 mg/kg、27.9 mg/kg、67.2 mg/kg；將延胡索總生堿滴丸劑實(shí)驗(yàn)組和丹參滴丸實(shí)驗(yàn)組給藥劑量，溶于生理鹽水，配成至所需濃度，混勻即可。各組實(shí)驗(yàn)動物均在冠脈結(jié)扎30 min后，經(jīng)十二指腸給藥，給藥體積為3 mL/kg。

2.2 犬急性心肌缺血模型的造模方法

上述5組實(shí)驗(yàn)動物，每只實(shí)驗(yàn)動物分別稱重，用戊巴比妥納(30 mg/kg)靜脈注射麻醉后，將犬仰臥并固定于保溫手術(shù)臺上。

首先在腹股溝區(qū)切開長約2～3 cm的皮膚，分離剝露出股動脈和股靜脈，股動脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎成死結(jié)，近心端用止血鉗夾緊，插入帶有三通閥的無菌聚乙烯管，手術(shù)線結(jié)扎固定，三通閥的一端連結(jié)壓力換能器，壓力換能器的另一端連結(jié)用BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。旋轉(zhuǎn)三通閥，用BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，測定動脈血壓；股靜脈按股動脈插管方法插入聚乙烯管，放開動脈夾，三通管的一端連結(jié)生理鹽水通道，旋轉(zhuǎn)三通閥，建立生理鹽水靜脈滴住通道，給予生理鹽水滴住，防止失液過多，電解質(zhì)紊亂。

在沿著腹部正中線切開上腹部皮膚，掏出十二指腸，在十二指腸上剪開一小口，插入橡膠軟管，進(jìn)行荷包式縫合，以備給予實(shí)驗(yàn)動物受試藥物。

切開頸部皮膚，分離氣管，進(jìn)行氣管剪口插管，接動物呼吸機(jī)，進(jìn)行人工呼吸，呼吸頻率16～18次/min,吸氣-呼氣1∶2，潮氣量350～550 mL,并根據(jù)血?dú)夥治稣{(diào)整通氣。

在氣管外側(cè)，剝離出頸外靜脈，遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端用動脈夾夾緊，在靜脈中央煎一小口，插入帶有三通閥的聚乙烯插管，止血鉗輕輕夾住沒入血管的插管部分，打開動脈夾，慢慢旋轉(zhuǎn)插管，直至插管進(jìn)入冠狀靜脈竇，手術(shù)線結(jié)扎，放止血鉗。取血時(shí)候，旋轉(zhuǎn)三通，血液即由導(dǎo)管口流出，以便于各個(gè)時(shí)時(shí)的采血，每次采血前應(yīng)放出少量血以防止枸櫞酸鈉影響指標(biāo)測定。

最后沿胸骨左緣切開皮膚及肌肉，切斷左第四肋骨胸骨端，暴露心臟，于離膈神經(jīng)前約1 cm處剪開心包膜，并將心包膜邊緣縫于胸壁上，使心臟左側(cè)壁充分暴露，找出心臟表面最粗大的橫行走向的血管(為冠狀動脈左前降支)。分離冠狀動脈左前降支中斷(離前降支起點(diǎn)下1/3處選一結(jié)扎點(diǎn))，穿線以備結(jié)扎，造成急性實(shí)驗(yàn)性心肌缺血模型。

針灸針分別插入犬左上、右上、左下肢皮膚表層，放置心電圖肢本導(dǎo)聯(lián)電極，通過BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)觀測標(biāo)準(zhǔn)n導(dǎo)聯(lián)心電圖。

縫置多點(diǎn)固定式心外膜電極，連結(jié)十六道生理記錄儀，描記心外膜電圖(ST段升高的電極數(shù)表示心肌梗死范圍的大小，以ST段升高量作為心肌損傷程度)。

手術(shù)穩(wěn)定20 min后，結(jié)扎冠脈，結(jié)扎線以下，心肌立即出現(xiàn)黑紫色變化，同時(shí)心電圖上出現(xiàn)缺血改變。

結(jié)扎30 min后，并立即經(jīng)十二指腸給予實(shí)驗(yàn)藥物或生理鹽水[1-4]。

2.3 造模成功的判斷方法

造模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)，以心電圖上出現(xiàn)的缺血改變?yōu)橹?，各?shí)驗(yàn)組動物，結(jié)扎時(shí)，心外膜心電圖上ST抬高大于2 mv，肢體導(dǎo)聯(lián)電極心電圖上J點(diǎn)抬高，或出現(xiàn)病理性Q波，即為造模成功。

2.4 血液樣本的采集方法

各實(shí)驗(yàn)組動物，分別與結(jié)扎前30 min(正常值)、結(jié)扎后30 min(缺血前即藥前)、十二指腸給藥30 min、60 min、120 min、180 min進(jìn)行抽血，抽血時(shí)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均用5 mL肝素鈉抗凝管2個(gè)，2 mL 32%檸檬酸鈉抗凝管2個(gè)、2 mL EDTA-K抗凝管1個(gè)抽血，并立即進(jìn)行血?dú)夥治?。抽血時(shí)，輕輕顛倒搖晃血液。

2.5 血漿心肌酶的測定方法

分別按肌酸激酶同工酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、羥丁酸脫氫酶(HBDH)等測定試劑盒的說明書配制好反應(yīng)液，并放置在AthlonX GLAMOUR2000全自動生化分析儀機(jī)器盤中；取2.5項(xiàng)下各時(shí)間段的枸櫞酸鈉抗凝管血液樣本，放置在離心機(jī)中，以2 500 r/min的速度，離心5 min，取血清，放入1.5 mLEP管中，放在AthlonX GLAMOUR2000全自動生化分析儀機(jī)器盤中，利用Autoanalyzer操作軟件，設(shè)置好參數(shù)，進(jìn)行測定，并記錄。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 肌酸激酶同工酶(CK)測定

由表1可知，模型組隨著冠脈結(jié)扎時(shí)間的延長逐漸升高；延胡索總生物堿滴丸劑高、中、低劑量組和丹參滴丸陽性組，都能明顯抑制心肌缺血引起的CK升高，與模型組比較，其相對變化率明顯低于模型對照組(P<0.05)。

3.2 乳酸脫氫酶(LDH)活性的測定

由表2可知，隨著冠脈結(jié)扎時(shí)間的延長，乳酸脫氫酶LDH含量持續(xù)升高，延胡索總生物堿滴丸劑高、中、低劑量組和丹參滴丸陽性組，均能明顯抑制LDH的升高,與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)。

3.3 對犬肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性的測定

表1 延胡索生物堿滴丸對犬血清CK活性的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01;與本組給藥前比較，#P<0.05，##P<0.01

表2 延胡索生物堿滴丸對犬血清LDH活性的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01;與本組給藥前比較，#P<0.05，##P<0.01

表3 延胡索生物堿滴丸劑對犬血清CK-MB活性的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01;與本組給藥前比較，#P<0.05，##P<0.01

由表3可知，模型組隨著冠脈結(jié)扎時(shí)間的延長，CK-MB持續(xù)升高，而延胡索總生物堿滴丸劑高、中、低劑量組和丹參滴丸陽性組能抑制血清CK-MB升高，與模型組比較，有顯著差異(P<0.05)；與自身藥前值比較，延胡索總生堿滴丸劑高、中、低劑量組和丹參滴丸陽性組在給藥后，血清CK-MB含量變化不明顯(P>0.05)。

3.4 對犬血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的測定

由表4可知，冠脈結(jié)扎后，模型組血清AST持續(xù)升高，延胡索總生物堿滴丸劑高、中、低劑量組能抑制血清AST的升高，與模型組比較，延胡索總生物堿滴丸劑中劑量組在60 min后，抑制作用明顯，且有顯著性差異(P<0.05)；延胡索總生物堿滴丸劑高、低劑量組和丹參滴丸陽性組，能抑制血清AST升高，但和模型組比較，無顯著性差異(P>0.05)。

表4 延胡索總生物堿滴丸劑對犬血清AST的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01;與本組給藥前比較，#P<0.05，##P<0.01

3.5 對血清羥丁酸脫氫酶(HBDH)的測定

由表5可知，冠脈結(jié)扎后，模型組血清HBDH持續(xù)升高，延胡索總生物堿滴丸劑高、低劑量組和丹參滴丸陽性組，能明顯抑制血清HBDH的增高，但和模型組比較，無顯著性差異(P>0.05)；延胡索總生物堿滴丸劑中劑量組，能明顯抑制血清HBDH的增高，且和模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)。

表5 延胡索總生物堿滴丸劑對犬血清羥丁酸脫氫酶(HBDH)的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01;與本組給藥前比較，#P<0.05，##P<0.01

4 討論

犬開胸結(jié)扎冠狀動脈法建立心肌缺血模型，創(chuàng)傷大、手術(shù)復(fù)雜,但仍是最接近人臨床冠心病人的模型方法。肌酸磷酸激酶(CK)廣泛存在于胞漿中，尤其以心肌細(xì)胞中較多，當(dāng)心肌細(xì)胞損傷時(shí)CK溢出，血清CK活性越高，反映心肌損傷越嚴(yán)重，臨床上，該酶主要用于診斷心肌梗塞，且該酶對心肌梗塞診斷的特異性高于乳酸脫氫酶(LDH)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，為早期診斷急性心肌梗塞的一項(xiàng)敏感指標(biāo)[5]。按照國家中藥新藥治療冠心病藥效學(xué)的技術(shù)要求，本實(shí)驗(yàn)觀察了延胡索總生物堿滴丸對犬急性心肌缺血模型的心肌酶譜影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：模型組隨著冠脈結(jié)扎時(shí)間的延長逐漸升高；延胡索總生物堿滴丸高、中、低劑量組和丹參滴丸組，都能明顯抑制心肌缺血引起的CK升高，與模型組相比，其相對變化率明顯低于模型對照組(P<0.05)。與各給藥前自身比較，模型組給予生理鹽水后30～180 min，CK變化率明顯高于藥前值；延胡索生物堿滴丸高、低劑量組、丹參滴丸陽性對照組，藥后30～60 min，CK變化率明顯低于藥前值；中劑量組藥后30～180 min，均低于藥前值。延胡索總生物堿滴丸起效較快，作用時(shí)間長，有些指標(biāo)優(yōu)于丹參滴丸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明延胡索總生物堿滴丸可有效降低心肌酶的濃度，對犬急性心肌缺血模型有保護(hù)作用。