黃家望，謝希，陳平安，袁娉，廖燦，劉俊杰，李玲*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208; 4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

胃潰瘍主要是指胃黏膜被胃消化液自身消化造成的超過黏膜肌層的組織損傷，是發(fā)生于賁門與幽門之間的炎性壞死病變，是消化性潰瘍中最常見的一種，其表現(xiàn)為中央部位炎性壞死和典型水腫[1]。其主要機(jī)制與水液代謝的動(dòng)態(tài)平衡密切相關(guān)。無水乙醇等化學(xué)因素所致的急性胃損傷模型伴有細(xì)胞內(nèi)外特征性水腫反應(yīng)[2-3]。AQP1、AQP3、AQP4可通過促進(jìn)細(xì)胞連接的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)對(duì)傷口進(jìn)行修復(fù)[4]，是人體胃組織中主要表達(dá)的水通道蛋白[5]。附子理中湯由附子、人參、干姜、甘草、白術(shù)組成。附子理中湯在臨床主要用于“脾陽虛”等相關(guān)疾病的治療，但未見其對(duì)胃潰瘍藥效機(jī)制研究。實(shí)驗(yàn)過程中我們發(fā)現(xiàn)，模型組潰瘍周圍見水腫，正常對(duì)照組大鼠未出現(xiàn)水腫，而附子理中湯水煎液灌胃后能顯著改善大鼠胃潰瘍水腫。基于此，推測(cè)附子理中湯抗胃潰瘍的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)水液代謝平衡相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)擬在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究附子理中湯對(duì)大鼠水通道蛋白基因表達(dá)的影響，從水液代謝途徑探討附子理中湯抗食醋誘導(dǎo)的胃潰瘍的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo)，凈化工作臺(tái)(吳江凈化，YJ-875A)，超微量分光光度計(jì)(德國(guó)IMPLEN)，實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Bio-RadFX Connect)，微量移液器(德國(guó)eppendorf)、石蠟切片機(jī)(美國(guó)A0820)。

1.2 主要試劑

1.2.1 糯米白醋

萊陽魯花醋業(yè)食品有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)日期為2018年5月28日，保質(zhì)期24個(gè)月，食品生產(chǎn)許可證編號(hào)為SC10337068208749。

RT-PCR檢測(cè)相關(guān)試劑Trizol(Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(promega，A3500)，qPCR mix(promega,A6001)，AQP1、AQP3、AQP4引物(生工)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

200 g左右SD雄性大鼠20只，由斯萊克景達(dá)動(dòng)物公司提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SYXK(湘)2013-0005。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥品

藥物均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，按動(dòng)物體表面積劑量換算法，用雙蒸餾水制備大鼠臨床等效劑量的各藥物水溶液。見表1。

表1 藥物說明及小鼠臨床等效用量

2 研究方法

2.1 食醋干預(yù)大鼠胃潰瘍模型建立與實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)

將大鼠隨機(jī)分為空白組和食醋灌胃組，禁食4 h、禁水1 h后，以食醋灌胃建模，1.5 mL/(100 g·d)，連續(xù)灌胃5 d，灌胃后1 h恢復(fù)飲食飲水，食醋造模最后一天灌胃完后將食醋灌胃組隨機(jī)分為空白組、模型組、雷尼替丁組、附子理中湯組。

表2 實(shí)驗(yàn)分組與干預(yù)方式

2.2 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 一般情況

末次給藥后，大鼠禁水禁食8 h，處理動(dòng)物。常規(guī)記錄大鼠一般情況和體質(zhì)量，分離脾臟、胃臟并稱重。

2.2.2 HE染色法觀察大鼠胃腸組織病理變化

選取大鼠病變區(qū)胃組織和十二指腸，10%中性甲醛固定、梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，間斷連續(xù)5 μm厚切片，HE染色、脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

2.2.3 RT-PCR法檢測(cè)胃組織AQP1、AQP3、AQP4基因的表達(dá)

取胃組織，Trizol法提取各組肺組織總RNA，超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度后將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此cDNA為模板用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)操作均按相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。qPCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，循環(huán)40次。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組AQP1、AQP3、AQP4相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表3。

表3 引物序列

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 附子理中湯對(duì)胃潰瘍大鼠一般情況的影響

如圖1所示：空白組大鼠精神良好，毛發(fā)有光澤，活動(dòng)、進(jìn)食、排便正常，體質(zhì)量飲食自然增加；模型組出現(xiàn)豎毛、毛色缺乏光澤、弓背、蜷臥、活動(dòng)減少、便溏，肛周污穢，體質(zhì)量飲食下降，胃指數(shù)、脾指數(shù)下降，與空白組相比，差異顯著(P<0.05)；各藥物干預(yù)組均能不同程度的改善的一般情況，與模型組相比較，差異顯著(P<0.01、0.05)，干預(yù)效果為雷尼替丁稍優(yōu)于附子理中湯，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2 附子理中湯對(duì)胃潰瘍大鼠胃腸組織病理變化的影響

如圖2所示：正常大鼠胃組織大體觀見胃黏膜及黏膜皺襞正常，未見糜爛、出血、潰瘍?cè)?；模型組大鼠胃組織大體觀可見胃竇前壁食醋注射區(qū)形成圓形或橢圓形的深大潰瘍，邊緣整齊，狀如刀切，底部平坦，周圍糜爛充血水腫；各藥物組大體觀可見胃黏膜光整完好與正常無異，黏膜皺襞明顯，未見糜爛、出血水腫，可見潰瘍?cè)钚迯?fù)。

如圖3、4所示：正常大鼠顯微鏡下可見胃竇壁結(jié)構(gòu)完整，明顯可見黏膜、黏膜下層分層，黏膜腺體排列整齊，無黏膜上皮破壞、脫落、出血、無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，胞漿勻稱，無空泡及核固縮；模型組顯微鏡下可見胃竇壁結(jié)構(gòu)明顯破壞，黏膜腺體消失，黏膜面表層見滲出物及壞死組織，其下為肉芽組織，并見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，潰瘍周圍腺體胞漿有空泡，核固縮或細(xì)胞破裂，而間質(zhì)見充血水腫及新生毛細(xì)血管出現(xiàn)；各藥物組顯微鏡下可見胃竇壁局部腺體排列紊亂，滲出物及壞死組織逐漸吸收、排出，已被破壞的肌層由底部肉芽組織增生形成瘢痕充填修復(fù)，未見明顯出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

如圖5、6所示：正常大鼠十二指腸可見腸黏膜和黏膜下層結(jié)構(gòu)完整且連續(xù)，腸絨毛排列整齊，肌層正常，無黏膜上皮破壞、脫落、出血，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠腸黏膜和黏膜下層破壞且不連續(xù)，肌層受損，黏膜面表層見滲出物及壞死組織，其下為肉芽組織，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥嚴(yán)重；各藥物組腸黏膜和黏膜下層開始修復(fù)且部分見連續(xù)，肌層由底部肉芽組織增生形成斑痕組織充填修復(fù)，炎癥滲出物逐漸吸收、排出，見腸絨毛增生。

3.3 附子理中湯對(duì)胃潰瘍大鼠AQP1、AQP3和AQP4基因表達(dá)的影響

如圖7所示：食醋灌胃干預(yù)后，胃組織中AQP1表達(dá)水平下降,AQP3、AQP4表達(dá)水平增加，與正常對(duì)照組比較，差異顯著(P<0.05)。藥物干預(yù)后各組大鼠胃組織中AQP1水平不同程度增加，AQP3、AQP4水平不同程度降低，與模型組比較，差異顯著(P<0.05)。干預(yù)效果為雷尼替丁優(yōu)于附子理中湯。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量、飲食、胃指數(shù)、脾指數(shù)的比較

圖2 各組大鼠胃組織大體標(biāo)本的比較

圖3 各組大鼠胃組織病理變化的比較(HE，×40)

圖4 各組大鼠胃組織病理變化的比較(HE，×100)

圖5 各組大鼠十二指腸病理變化的比較(HE，×40)

圖6 各組大鼠十二指腸病理變化的比較(HE，×100)

圖7 各組大鼠胃組織中AQP1、AQP3和AQP4mRNA表達(dá)的比較

4 討論

食醋灌胃干預(yù)后使得大鼠胃黏膜受損，使胃上皮細(xì)胞間的緊密連接處脂肪蛋白質(zhì)、微循環(huán)等被破壞，胃的負(fù)擔(dān)加重或刺激過強(qiáng)，從而形成潰瘍[6]。潰瘍的發(fā)生與水液代謝的動(dòng)態(tài)平衡密切相關(guān)。水通道蛋白(AQPs)是近年發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)水液跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的一類膜蛋白[7-8]，在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)廣泛分布，人體的胃組織中AQP1、AQP、3AQP4表達(dá)強(qiáng)烈[5]。有研究表明[9-11]，AQP1和AQP4在維持胃黏膜完整性方面起著重要作用，增強(qiáng)了胃對(duì)乙醇所致水腫的防御,AQP3在胃腺癌細(xì)胞中起著重要作用，參與幽門螺旋桿菌感染引發(fā)胃癌的過程。胃炎、胃潰瘍等胃腸道疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸均與AQPs對(duì)水液代謝調(diào)節(jié)密切相關(guān)[12-13]。AQP1和AQP4還參與了乙醇和辣椒素致急性胃黏膜水腫和損傷的進(jìn)程[2]。因此，水通道蛋白是藥物治療水液代謝平衡失調(diào)的重要作用靶點(diǎn)[14]。本研究結(jié)果證實(shí)AQP1、AQP3和AQP4在胃潰瘍的發(fā)病機(jī)制中有著重要作用，通過介導(dǎo)水液跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)水液代謝的動(dòng)態(tài)平衡，改善胃黏膜的潰瘍程度，起到治療作用，與潰瘍程度成負(fù)相關(guān)。

附子理中湯為《傷寒論》理中湯加大辛大熱之附子而成，是傳統(tǒng)的溫中名方?！秱摗分杏涊d理中湯由附子、人參、干姜、白術(shù)和炙甘草組成；具有補(bǔ)虛回陽，溫中祛寒，補(bǔ)氣健脾的作用。方中附子和干姜具有抗?jié)兒玩?zhèn)痛抗炎的作用，對(duì)溫里藥治療臍腹冷痛起到了加強(qiáng)作用；甘草、白術(shù)也都具有抗消化道潰瘍、抗炎鎮(zhèn)痛的藥理作用；且甘草解百毒，與附子、干姜同煮，可使附子毒性大減。諸藥合用，標(biāo)本兼顧，脾腎雙補(bǔ)，溫中散寒，中陽建運(yùn)，復(fù)使清陽上升，濁陰下降，清濁各行其道，故臨床療效顯著?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究證明[15]，附子理中湯能增強(qiáng)小鼠的耐寒能力，對(duì)醋酸引起的小鼠腹痛有顯著的鎮(zhèn)痛作用，同時(shí)還可顯著提高胃黏膜的SOD活性，降低MDA的含量，發(fā)揮其對(duì)胃黏膜保護(hù)作用，從而加速潰瘍愈合。

綜上所述，附子理中湯能顯著提高AQP1的表達(dá),下調(diào)AQP3和AQP4的表達(dá)，表明附子理中湯抗食醋誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍的藥效機(jī)制可能是通過提高AQP1和下調(diào)AQP3、AQP4的表達(dá)，調(diào)節(jié)水液代謝動(dòng)態(tài)平衡，介導(dǎo)水液跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而起到保護(hù)胃黏膜的作用，最終改善大鼠胃組織潰瘍和水腫程度。但水液代謝平衡與AQP1、AQP3和AQP4是否為食醋誘導(dǎo)大鼠胃潰瘍的唯一機(jī)制還需進(jìn)一步的機(jī)制研究，而附子理中湯的藥效成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)多樣，其抗食醋誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍的物質(zhì)基礎(chǔ)需要進(jìn)一步研究。