姚娜，黃燕明，李雪銀，陳桂生，康志英，2

1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.寧夏隆德縣六盤山中藥資源開發(fā)有限公司，寧夏 固原 756300

麩炒枳殼配方顆粒是以麩炒枳殼飲片為原料，經(jīng)過(guò)水提、真空濃縮之后將濃縮液干燥成提取物，將提取物加適量輔料制備成顆粒后進(jìn)行包裝制備而成。原料麩炒枳殼為枳殼經(jīng)炮制后加工制成。生枳殼具有理氣寬中、行滯消脹的功能，臨床上用于胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內(nèi)停、臟器下垂，麩炒后增強(qiáng)了健脾消脹作用[1-2]。枳殼中包含揮發(fā)油、黃酮類、少量香豆素及生物堿等[3-4]，其中柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷是主要的有效成分。生枳殼經(jīng)炮制后，柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷含量會(huì)有顯著變化[5-9]。已有文獻(xiàn)大多是單獨(dú)測(cè)定枳殼或麩炒枳殼飲片及其復(fù)方制劑的主成分含量，該方法不能同時(shí)適用于指紋圖譜，且關(guān)于麩炒枳殼中藥配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也尚未統(tǒng)一。為了有效控制和評(píng)價(jià)麩炒枳殼制備而來(lái)的配方顆粒產(chǎn)品的質(zhì)量，本研究利用HPLC建立同步測(cè)定麩炒枳殼配方顆粒特征圖譜和定量檢測(cè)指標(biāo)成分柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的方法[10-18]。

1 材料

1.1 儀器

超純水器(Simplicity，美國(guó)密理博Millipore公司)；超聲機(jī)(KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；Ultimate 3000 DGLC高效液相色譜儀；Agilent 1260高效液相色譜儀；十萬(wàn)分之一電子分析天平(MS205DU，瑞士Mettler toledo公司)。

1.2 試藥

枳殼對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：120981-201104，規(guī)格：0.5 g/瓶)；柚皮苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110722-201312，純度：94.7%)；新橙皮苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111857-201102，純度：99.6%)；橙皮苷(中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院，批號(hào)：110721-201316，純度：95.3%)；乙腈和磷酸色譜級(jí)；甲醇分析純。

10批顆粒成品均來(lái)自廣州市香雪制藥股份有限公司(批號(hào)分別為201806001～201806010)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

使用C18色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相A，水(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3)為流動(dòng)相B，0～20 min，流動(dòng)相A為22%、流動(dòng)相B為78%，20～30 min，流動(dòng)相A為22%～90%，流動(dòng)相B為78%～10%；波長(zhǎng)為283 nm。理論塔板數(shù)以柚皮苷峰計(jì)，不低于3000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成混合對(duì)照品溶液，其中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷質(zhì)量濃度分別為80、4、40 μg·mL-1。

2.3 供試品溶液的制備

取成品約0.1 g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，并加入50%甲醇100 mL，稱質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)15 min，冷卻后再稱質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)回減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 測(cè)定法

對(duì)照品溶液與供試品溶液進(jìn)樣各10 μL，記錄色譜圖。

2.5 測(cè)定結(jié)果

10批麩炒枳殼配方顆粒的柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為83.12～86.04 mg·g-1，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為84.48 mg·g-1，橙皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.683～4.761 mg·g-1，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.133 mg·g-1，新橙皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.00～47.61 mg·g-1，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.73 mg·g-1；10批麩炒枳殼配方顆粒指紋圖譜中有5個(gè)色譜峰能穩(wěn)定重現(xiàn)，故確立了5個(gè)特征峰，其中2號(hào)峰鑒定為柚皮苷，3號(hào)峰鑒定為橙皮苷，4號(hào)峰鑒定為新橙皮苷。

注：2.柚皮苷；3.橙皮苷；4.新橙皮苷。圖1 10個(gè)批次麩炒枳殼配方顆粒成品HPLC疊加圖

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性試驗(yàn) 取配方顆粒成品、麥芽糊精及枳殼對(duì)照藥材分別按2.3項(xiàng)下方法制備，按2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明，5個(gè)共有色譜峰的鑒定均不受溶劑及輔料等因素干擾，方法專屬性良好。

注：A.空白溶劑；B.枳殼對(duì)照藥材；C.輔料；D.麩炒枳殼配方顆粒成品；2.柚皮苷；3.橙皮苷；4.新橙皮苷。圖2 麩炒枳殼配方顆粒成品特征圖譜專屬性試驗(yàn)

2.6.2 精密度試驗(yàn) 取同一批麩炒枳殼配方顆粒制備的供試品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件于高效液相色譜儀上連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以2號(hào)峰柚皮苷峰為參照，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果其RSD值為0.00%～0.16%，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間基本無(wú)差異，表明儀器精密度良好。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一個(gè)批次的麩炒枳殼配方顆粒樣品，平行6份，按2.3項(xiàng)下方法制備，按2.1項(xiàng)下方法分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。以2號(hào)峰柚皮苷峰為參照，計(jì)算各圖譜的相對(duì)保留時(shí)間，RSD值為0.00%～0.11%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取某一批麩炒枳殼配方顆粒供試品溶液，按2.1項(xiàng)下方法，分別在0、2、4、6、8、12、29、48 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。以2號(hào)峰柚皮苷峰為參照，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間，各圖譜特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0.00%～0.96%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 中間精密度試驗(yàn) 分別考察不同分析人員、不同日期、不同設(shè)備對(duì)精密度的影響，結(jié)果RAD在0.00%～0.87%，表明該方法精密度良好。

2.6.6 耐用性試驗(yàn) 取同一批麩炒枳殼配方顆粒供試品，分別使用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Elite Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Welch Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3種型號(hào)的色譜柱測(cè)定，記錄色譜圖。以2號(hào)峰柚皮苷峰為參照，RSD<3.28%，表明該方法耐用性良好。

2.6.7 相對(duì)保留時(shí)間規(guī)定值的確立 經(jīng)不同色譜柱及不同設(shè)備考察，供試品的色譜圖中柚皮苷峰與相應(yīng)的參照物峰保留時(shí)間相同，以柚皮苷峰為S峰，計(jì)算特征峰1、3、4、5的相對(duì)保留時(shí)間，根據(jù)不同條件相對(duì)保留時(shí)間變化情況確定規(guī)定值情況如下：峰1為0.85、峰3為1.09、峰4為1.30、峰5為2.00，且偏差控制在±5%以內(nèi)。

2.7 含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.7.1 線性關(guān)系及范圍 取混合對(duì)照品溶液(柚皮苷：77.65 μg·mL-1，橙皮苷：3.869 μg·mL-1，新橙皮苷：42.51 μg·mL-1)，采用自動(dòng)進(jìn)樣器分別進(jìn)樣0.5、1、2、5、10、15、20 μL，柚皮苷進(jìn)樣量為0.038 8、0.077 6、0.155 3、0.388 2、0.776 5、1.164 8、1.553 0 μg，在283 nm下測(cè)定，以柚皮苷峰面積積分值對(duì)柚皮苷對(duì)照品的進(jìn)樣量進(jìn)行回歸分析，其回歸方程為：Y=21.8X-0.013，r=1，結(jié)果表明柚皮苷在0.038 8～1.553 0 μg，與峰面積呈良好線性關(guān)系。橙皮苷進(jìn)樣量為0.001 9、0.003 9、0.007 7、0.019 3、0.038 7、0.058 0、0.077 4 μg，在283 nm下測(cè)定，以橙皮苷峰面積積分值對(duì)橙皮苷對(duì)照品的進(jìn)樣量進(jìn)行回歸分析，其回歸方程為：Y=21.792X-0.010 4，r=0.999 9，結(jié)果表明橙皮苷在0.001 9～0.077 4 μg，峰面積呈良好線性關(guān)系；新橙皮苷進(jìn)樣量為0.021 2、0.042 5、0.085、0.212 6、0.425 1、0.637 6、0.850 2 μg，在283 nm下測(cè)定，以新橙皮苷峰面積積分值對(duì)新橙皮苷對(duì)照品的進(jìn)樣量進(jìn)行回歸分析，其回歸方程為：Y=23.909X-0.017，r=1，結(jié)果表明，新橙皮苷在0.021 2～0.850 2 μg，濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.7.2 重復(fù)性試驗(yàn) 同2.6.3項(xiàng)下，并對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，柚皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為84.30 mg·g-1，RSD為1.29%；橙皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.68 mg·g-1，RSD為1.01%；新橙皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.46 mg·g-1，RSD為1.15%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同2.6.4項(xiàng)下，對(duì)所得峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并計(jì)算RSD。柚皮苷對(duì)照品溶液和供試品溶液的RSD分別為0.29%、0.31%；橙皮苷對(duì)照品溶液和供試品溶液的RSD分別為1.85%、0.32%；新橙皮苷對(duì)照品溶液和供試品溶液的RSD分別為0.20%、0.37%，表明麩炒枳殼配方顆粒供試品溶液及柚皮苷、新橙皮苷以及橙皮苷對(duì)照品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.4 加樣回收率 精密稱取已測(cè)柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量的麩炒枳殼配方顆粒適量，平行9份，分別精密加入低、中、高濃度的柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷對(duì)照品，按供試品項(xiàng)下操作，依法測(cè)定，平均回收率分別為98.86%、99.21%、99.66%，RSD分別為2.11%、2.21%、1.52%，結(jié)果表明該方法回收率良好。

2.7.5 中間精密度試驗(yàn) 同2.6.5項(xiàng)下，柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷含量的RAD在0.01%～1.83%，表明該方法中間精密度良好。

2.7.6 耐用性試驗(yàn) 同2.6.6項(xiàng)下測(cè)定，柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷含量的RSD為0.67%～2.09%，表明該方法耐用性良好。

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)比了50%甲醇與純甲醇作為溶劑的區(qū)別：溶劑為純甲醇時(shí)，會(huì)引起溶劑與流動(dòng)相不匹配現(xiàn)象，導(dǎo)致產(chǎn)生嚴(yán)重的前沿峰，使峰面積比正常峰面積小，為消除這種影響，對(duì)照品和供試品制備時(shí)采用50%的甲醇溶解，峰形良好，相同進(jìn)樣量情況下，響應(yīng)值顯著提高，檢測(cè)更為靈敏。故研究方法采用50%甲醇作為對(duì)照品和供試品溶液配置的溶劑。

在柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷的含量測(cè)定中，對(duì)其定量下限進(jìn)行研究?；旌蠈?duì)照品溶液(柚皮苷質(zhì)量濃度：77.65 μg·mL-1，橙皮苷質(zhì)量濃度：3.869 μg·mL-1，新橙皮苷質(zhì)量濃度：42.51 μg·mL-1)適量，進(jìn)樣0.5 μL，依法測(cè)定。橙皮苷峰信噪比約為10∶1時(shí)，柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的進(jìn)樣量分別為0.038 8、0.021 2、0.001 9 μg，連續(xù)進(jìn)樣5次，柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷RSD依次為1.85%、1.21%、1.42%。即確定本含量測(cè)定方法的定量下限為柚皮苷0.038 8 μg、橙皮苷0.001 9 μg、新橙皮苷0.021 2 μg。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中建立HPLC能夠?qū)崿F(xiàn)同步測(cè)定麩炒枳殼配方顆粒特征圖譜與柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量，且該方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，適用性良好，可以作為麩炒枳殼配方顆粒質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)的依據(jù)之一。