張春艷，李玥，楊莎莎，成睿珍

1.天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 300450；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193

清感退熱湯加減方是天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院兒科廣泛使用的臨床經(jīng)驗方，由“清感退熱湯”作為基礎(chǔ)方進行加減而成。清感退熱湯經(jīng)過多年臨床實踐，結(jié)合理論辨證施治，已取得了良好的療效，以本方為基礎(chǔ)的加減方已治療了數(shù)百例患者[1]。

研究表明，不同的提取工藝會對湯劑的療效產(chǎn)生不同程度的影響[2-3]。然而，作為兒科常用藥，清感退熱湯加減方目前尚未有較為完善的提取工藝。為了明確清感退熱湯的提取工藝，確保其質(zhì)量和臨床療效，本文對加減方中君藥葛根，臣藥黃芩的有效成分進行測定，以葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷的含量為指標，采用正交試驗結(jié)合綜合加權(quán)評分法優(yōu)化清感退熱湯的提取工藝，為研發(fā)穩(wěn)定、可行、質(zhì)量可控的清感退熱湯提取工藝提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Alltech 1500系列Q 05型高效液相色譜儀；Agilent Eclipse C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；UV-6100 PCS型紫外可見分光光度計(上海美普達有限公司)；FA 2104型精密電子分析天平(上海舜宇恒平科技儀器有限公司)；JE 1001型電子天平(上海浦春計量儀器有限公司)；KDM調(diào)溫電熱套(山東省鄄城精佳儀器有限公司)；SB 25-12 DT超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試藥

黃芩苷對照品(批號：MUST-11101403)、漢黃芩苷對照品(批號：MUST-16111611)、葛根素對照品(批號：MUST-11043001)均購于成都曼斯特生物科技有限公司，純度≥98%；甲醇、乙腈色譜純(天津市康科德科技有限公司)；磷酸為優(yōu)級純(天津市江天化工技術(shù)有限公司，純度≥98%)；實驗用水為娃哈哈純凈水。

中藥飲片由天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)科提供，經(jīng)劉海副主任中藥師鑒定，均符合2015年版《中華人民共和國藥典》的規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1方法學(xué)的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱Agilent Eclipse C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脫(見表1)；流速1.0 mL·min-1；檢測波長270 nm；柱溫為常溫；進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品葛根素0.9 mg、黃芩苷2.9 mg、漢黃芩苷1.0 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取處方飲片：葛根10 g，黃芩10 g，生石膏30 g等，共108 g?；亓魈崛〔⒂?00目濾布對提取液進行過濾。取1 mL濾液置10 mL容量瓶中，用甲醇定容，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性供試品溶液的制備 按處方比例稱取除黃芩或除葛根以外的其余藥材，按2.1.3項下方法制備，分別制得無黃芩的陰性供試品溶液和無葛根的陰性供試品溶液。

2.1.5 專屬性試驗 精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定。結(jié)果表明此方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

注：A.混合對照品；B.供試品；C.無葛根的陰性供試品；D.無黃芩的陰性供試品；1.葛根素；2.黃芩苷；3.漢黃芩苷。圖1 對照品及供試品溶液HPLC圖

2.1.6 標準曲線的繪制 精密量取上述混合對照品儲備液，用甲醇逐級稀釋，制成一系列不同濃度的對照品溶液，按照2.1.1項下色譜條件進樣，以色譜峰面積(Y)為縱坐標，進樣量(X)為橫坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算。葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷的回歸方程分別為Y=3×109X-96 526(r=0.999 9)，Y=2×109X-215 803(r=0.999 9)，Y=5×109X-75 545(r=0.999 7)；線性范圍分別為：0.09～0.72、0.29～5.8、0.04～0.24 μg。結(jié)果表明，葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷在其相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.7 精密度試驗 精密吸取高、中、低3種不同濃度的葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷對照品溶液，按2.1.1項下的色譜條件連續(xù)進樣5次，測定3種成分的峰面積，計算各成分的含量，求得日內(nèi)精密度，其RSD值分別為0.46%、0.13%、0.52%。

取同一對照品溶液連續(xù)進樣3 d，測定峰面積，計算各成分的含量，求得日間精密度，其RSD值分別為0.12%、0.09%、0.36%。結(jié)果表明，實驗儀器的日間日內(nèi)精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取處方按2.1.3項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣，測定葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷3種成分的峰面積，計算各成分的含量，其RSD值分別為0.77%、0.21%、0.47%。結(jié)果表明，供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 重復(fù)性試驗 取處方按2.1.3項下方法制備供試溶液6份，按2.1.1項下色譜條件分析，測定葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷3種成分的峰面積，計算各成分的含量，其RSD值分別為0.68%、0.42%、0.54%，結(jié)果表明，此法重復(fù)性良好。

2.1.10 回收率試驗 精密量取已知含量的供試液6份，分別加入等量的對照品，按2.1.3項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。求得葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷的加樣回收率分別為100.10%、99.63%、101.01%，其RSD值分別為0.68%、1.44%、1.09%。結(jié)果表明，此方法加樣回收率良好。

2.2 最佳提取工藝的優(yōu)選

2.2.1 單因素考察 按處方量稱取藥材，分別加入6、8、10倍量水，均回流提取1次，每次1 h，平行3份。按2.1.1項下色譜條件分析，測定3種成分的峰面積并計算各成分的含量，求得葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷的提取量分別為：10倍量水22.5、81.64、8.91 mg·g-1(RSD值分別為1.27%、1.75%、1.81%)；8倍量水25.53、78.99、8.17 mg·g-1(RSD值分別為0.85%、0.09%、0.05%)；6倍量水19.87、66.38、7.24 mg·g-1(RSD值分別為0.41%、0.39%、0.32%)。

2.2.2 多指標成分權(quán)重分析 按照處方中君臣佐使及含量進行分析，將葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷的權(quán)重系數(shù)分別定為0.6、0.2、0.2。

綜合評分=(葛根素含量/葛根素最大含量)×100×0.6+(黃芩苷含量/黃芩苷最大含量)×100×0.2+(漢黃芩苷含量/漢黃芩苷最大含量)×100×0.2

(1)

2.2.3 正交設(shè)計 采用正交設(shè)計IIV3.1優(yōu)選最佳工藝，選擇3因素3水平(見表2)，按L9(34)正交設(shè)計進行試驗。以處方中主要藥材的主要有效成分作為測定指標，采用加權(quán)綜合評分法，對實驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，以指標成分的含量和綜合評分值對實驗結(jié)果進行直觀分析(見表3)和方差分析(見表4)，確定最佳提取工藝。

表2 因素水平表

表3 正交試驗結(jié)果

表4 綜合評分方差分析

由表2的R值直觀分析和表3方差分析可知，各考察因素對考察指標影響大小的次序為C>A>B，其中加水量(A)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.10)，提取次數(shù)(C)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而提取時間(B)在實驗所設(shè)范圍內(nèi)無差異。綜合正交設(shè)計結(jié)果、時間和成本問題，得出最佳試驗方案為A2B1C3，即8倍量水，提取0.5 h，提取3次。

2.2.4 驗證實驗 按處方量比例稱取同一批藥材，平行3份，按優(yōu)化的最佳提取工藝進行提取，測得葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷的質(zhì)量分數(shù)分別為37.35、135.58、15.53 mg·g-1，RSD分別為1.06%、0.13%、0.19%。結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 流動相的選取

有關(guān)葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷的含量測定，經(jīng)查閱文獻[4-7]發(fā)現(xiàn)，研究者多用乙腈、甲醇作為有機相，實驗中選取了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水作為流動相。實驗發(fā)現(xiàn)當選用甲醇-0.1%磷酸水作為流動相時，在相同的分離時間內(nèi)各峰的峰形和分離度均較好。

3.2 波長的選取

分別取葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷對照品溶液，用紫外可見分光光度計檢測出各指標成分的最大吸收波長分別為239、279、270 nm。因葛根素和其他成分的最大吸收峰差距較大，故分別選取240、245、250、255、260、265、270、275 nm作為檢測波長，對供試品溶液進行分析。實驗發(fā)現(xiàn)，270 nm下葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷的峰面積響應(yīng)值相對較大，故以270 nm作為檢測波長。

3.3 權(quán)重系數(shù)的選取

本實驗通過對主要藥味的有效成分進行含量測定，根據(jù)復(fù)方中不同藥味的地位分配權(quán)重，進行多指標成分權(quán)重分析。葛根甘、辛、涼，有解肌退熱，生津止渴等功效，可協(xié)助柴胡透汗解熱，主要用于外感發(fā)熱惡寒無汗、項背強痛等，為方中君藥，故將葛根素權(quán)重系數(shù)定為0.6。黃芩苦寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效[8]，能清瀉上焦肺火、除腸中濕熱，為方中臣藥，有效成分為黃芩苷和漢黃芩苷，故其權(quán)重系數(shù)分別定為0.2和0.2。

3.4 提取工藝的確定

通過表3中的R值，直觀分析得出的最佳工藝是A2B3C3，即8倍量水，提取1.5 h，提取3次。由表3方差分析表可知，提取時間在實驗所設(shè)范圍內(nèi)對實驗結(jié)果無影響，從時間和成本方面考慮，最終選擇最短提取時間0.5 h，從而得出最佳工藝為A2B1C3。

本文首次測定了清感退熱湯中葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷3種有效成分的含量，并優(yōu)化了提取工藝。研究表明，本法簡便、靈敏、重復(fù)性好，可用于清感退熱湯加減方的質(zhì)量控制，以確保臨床療效；提取工藝穩(wěn)定可行，為進一步開發(fā)利用該處方提供了參考。