王鵬思，吳佩玲，薛健

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193

鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的干燥莖。11月至翌年3月采收，可加工成“鐵皮楓斗(耳環(huán)石斛)”和“鐵皮石斛”[1]?，F(xiàn)代研究表明鐵皮石斛主要含有芪類、酚類、多糖、氨基酸、木質(zhì)素類等成分，具有增強免疫、降血糖、抗腫瘤等藥理作用[2-3]。鐵皮石斛野生資源已瀕臨枯竭，但“救命仙草、藥界大熊貓”鐵皮石斛的需求量卻越來越大，因此我國一些科研機構(gòu)和種植公司為滿足這種需求，經(jīng)過近20年的研究和探索，實現(xiàn)了鐵皮石斛種苗繁育和人工栽培技術的突破性進展。目前鐵皮石斛主要是通過人工種植的方式進行生產(chǎn)，在此過程中極易發(fā)生病蟲害，藥農(nóng)難免會使化學農(nóng)藥進行防治[4-6]。但由于藥農(nóng)缺乏病蟲害防治相關基礎知識和常識，常常是依照農(nóng)藥經(jīng)銷商的推薦意見購買和使用農(nóng)藥，導致農(nóng)藥亂用濫用現(xiàn)象普遍，嚴重威脅藥材的質(zhì)量和產(chǎn)區(qū)生態(tài)安全[7]。

目前，關于鐵皮石斛中的農(nóng)藥殘留多采用氣相色譜-電子捕獲檢測器(GC-ECD)[8-9]、氣相色譜-火焰光度檢測器(GC-FPD)[10]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[11]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[12-13]等，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[14]雖有報道，但僅測定了8種有機磷農(nóng)藥，總體測定農(nóng)藥品種偏少，難以較全面地了解鐵皮石斛中的農(nóng)藥殘留狀況，從而無法對鐵皮石斛中的殘留農(nóng)藥進行較全面的風險評估。

鮮鐵皮石斛未經(jīng)加工、炮制，作為藥食同源物質(zhì)，采收后可直接鮮食，且易于人體吸收，價格較低，適合大眾消費。因此，本研究以鮮鐵皮石斛為研究基質(zhì)，建立了鮮鐵皮石斛中141種農(nóng)藥及代謝物的HPLC-MS/MS檢測方法，從而為更加真實、全面地了解鐵皮石斛中的農(nóng)藥殘留狀況提供一種簡便快捷、經(jīng)濟節(jié)約、穩(wěn)定耐用的多殘留分析方法，該方法也可為相關部門對鮮鐵皮石斛藥材的安全監(jiān)測提供重要參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜串聯(lián)AB SCIEX 5500 QTRAP質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源ESI源)；Milli-Q超純水機(美國Millipore公司)；PL203型電子天平(瑞士梅特勒)；VORTEX-5旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；TDZ5-WS低速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；LABOROTA4000/4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(德國海道夫)。

1.2 試劑與材料

乙腈(HPLC級，美國Fisher公司)；乙腈、冰醋酸(HAc)(分析純，北京化工廠)；甲酸(LC-MS級，上海安譜實驗科技股份有限公司)；無水硫酸鎂、無水乙酸鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；超純水；141種農(nóng)藥及其代謝物(100 mg·L-1)均購自中國農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；空白鮮鐵皮石斛樣品經(jīng)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所張本剛研究員鑒定為為蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的新鮮莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

2.1.1 混合儲備液 分別準確吸取適量單一對照品溶液(100 mg·L-1)，用色譜乙腈稀釋，制成各農(nóng)藥組分質(zhì)量濃度均為500 ng·mL-1的混合儲備液，保存于-18 ℃冰箱中。

2.1.2 基質(zhì)匹配對照品溶液 按照2.2項下樣品前處理步驟制備不含目標化合物的空白基質(zhì)溶液，準確吸取適量混合儲備液，用基質(zhì)溶液作為稀釋溶劑制成質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、40、60、80、100 ng·mL-1的基質(zhì)匹配對照品溶液。

2.2 樣品前處理

取供試品，粉碎成漿狀，取約5 g，精密稱定，置50 mL具塞離心管中，準確加入10 mL 1%乙酸乙腈，渦旋3 min，加入1 g無水乙酸鈉，渦旋混勻，再加入1 g 無水硫酸鎂，立即搖散，并渦旋1 min，離心(4000 r·min-1)5 min，精密吸取上清液1 mL，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，即得。

2.3 分析條件

2.3.1 色譜條件 C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL；流動相A：色譜乙腈，流動相B：0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序為：0～0.5 min，70%～70%B；0.5～9 min，70%～10%B；9～13 min，10%～10%B；13～13.1 min，10%～70%B；13.1～18 min，70%～70%B。分析時間：18 min。

2.3.2 質(zhì)譜條件 以三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，電噴霧(ESI)離子源，監(jiān)測模式為多反應監(jiān)測(MRM)；掃描方式：正離子(131個化合物)和負離子(10個化合物)同時掃描，離子噴霧電壓(IS)+5.5 kV；離子噴霧電壓(IS)-4.5 kV；離子源溫度550 ℃，霧化氣(GS1)：50 psi(1 psi≈6.895 kPa)，輔助氣(GS2)：50 psi，氣簾氣(CUR)：35 psi，各化合物參考保留時間、監(jiān)測離子對、去簇電壓(DP)、碰撞電壓(CE)見表1。

表1 141種農(nóng)藥及代謝物的保留時間、質(zhì)譜參數(shù)

續(xù)表1

續(xù)表1

2.4 方法學驗證

2.4.1 方法的線性和靈敏度 將2.1.2項下配制的基質(zhì)匹配對照品溶液在2.3項下分析條件下進樣，以各農(nóng)藥的質(zhì)量濃度X為橫坐標，以各農(nóng)藥的定量離子對應的峰面積Y為縱坐標繪制校正曲線。結(jié)果顯示，141種農(nóng)藥在各自的線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系，r均≥0.995 0(見表2)。本研究通過向空白鐵皮石斛樣品中添加不同量的農(nóng)藥混合對照品溶液以制備多個較低水平(1、2、5、10 μg·kg-1)的加標樣品，按照2.2項下樣品前處理制備供試品溶液并在2.3項下分析條件下進行測定，以信噪比(S/N)大于或等于10時的最低添加水平為該農(nóng)藥的定量限(LOQ)。結(jié)果(見表2)可知，各化合物的定量限均在1～10 μg·kg-1。

表2 141種農(nóng)藥及代謝物方法學驗證數(shù)據(jù)

續(xù)表2

2.4.2 方法的回收率和精密度 準確稱取空白鐵皮石斛樣品5.0 g于50 mL具塞離心管中，分別添加適量的500 μg·L-1的混合儲備液，制備10、20、50 μg·kg-13個濃度水平(每個水平重復3次)的添加樣品，放置30 min以上，按照正文2.2項下中“準確加入1%乙酸乙腈10 mL”開始至樣品前處理完成。為減小基質(zhì)效應的影響，同時制備空白鐵皮石斛基質(zhì)溶液，并配制10、20、50 μg·L-1的基質(zhì)混合對照品溶液作為計算回收率的對照溶液。由表2知，除滅蠅胺、吡蚜酮、甲基硫菌靈、聯(lián)苯肼酯外，其余137種農(nóng)藥及代謝物的回收率均在60.0%～120.0%，RSD均<20%，n=3。

《GB/T 27417-2017 合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》中指出添加質(zhì)量濃度水平<0.1 mg·kg-1時，回收率在60.0%～120.0%即可，王京輝等[15]指出多殘留分析(一次需要分析數(shù)十、甚至上百種農(nóng)藥)中60%～140%的回收率范圍是可以被接受的。因此，本研究所建立的方法符合農(nóng)藥多殘留分析的要求。

3 討論

3.1 農(nóng)藥品種的選擇

本研究依據(jù)以下原則，遴選出了目前對于中藥材鐵皮石斛具有監(jiān)測意義并且適于HPLC-MS/MS檢測的141種農(nóng)藥品種。這些原則是：1)中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第194、199、274號等公告中明令禁止或限制在中藥材種植中使用的農(nóng)藥(http：//www.foodmate.net/law/dongtai/177625.html)，如涕滅威、殺撲磷、甲磺隆等；2)通過文獻調(diào)研[4-6]和實地調(diào)研等方式，針對性地選取防治鐵皮石斛病蟲害的常用農(nóng)藥品種，如多菌靈、吡蟲啉、苯醚甲環(huán)唑等；3)部分有毒理學意義的農(nóng)藥代謝物，如3-羥基克百威、特丁硫磷亞砜等；4)參考《美國藥典》《歐洲藥典》等規(guī)定的植物藥中有關農(nóng)藥殘留檢測品種，如二嗪磷等。

3.2 前處理條件的確定

3.2.1提取溶劑的選擇 丙酮、乙酸乙酯和乙腈是樣品中多農(nóng)藥殘留分析的常用提取溶劑。其中，丙酮易提取樣品中的色素等雜質(zhì)，且丙酮與水互溶，難以與水相分層。乙酸乙酯極性小，用其進行提取時大部分極性農(nóng)藥難以轉(zhuǎn)移到有機相中，且易提取基質(zhì)中的蠟質(zhì)、脂肪等非極性雜質(zhì)[16-17]。丙酮和乙酸乙酯還均易揮發(fā)，有刺激性氣味，對人體健康危害較大。而乙腈作為提取溶劑時，可萃取較寬范圍極性的多農(nóng)藥殘留，且可避免基質(zhì)中的蠟質(zhì)、脂肪等親脂雜質(zhì)的干擾?！吨腥A人民共和國藥典》《中華人民共和國國家標準》《AOAC Official Method》(2007.01)《BS EN 15662：2008》等公認的多農(nóng)藥殘留測定法中也均選用乙腈作為提取溶劑，因此本研究選用乙腈作為提取溶劑。此外，本研究涉及農(nóng)藥包括有機磷類、氨基甲酸脂類、磺酰脲類等多種類別的農(nóng)藥，多數(shù)農(nóng)藥在偏酸性條件下較穩(wěn)定，在堿性條件下易分解。因此，在乙腈中加1%乙酸，與鹽析時加入的乙酸鈉構(gòu)成緩沖體系，可增強酸堿敏感性農(nóng)藥在乙腈提取液中的穩(wěn)定性[18]。

3.2.2 凈化與否的確定 分散固相萃取法(d-SPE)是QuEChERS法中采用的凈化方法。分散固相萃取法使用較多的凈化劑材料有PSA、C18、GCB等。但經(jīng)過前期研究和文獻[19-20]發(fā)現(xiàn)PSA類吸附劑對甲磺隆、氯磺隆、胺苯磺隆等含羧基農(nóng)藥的吸附性較強以致此類農(nóng)藥難以回收。而GCB也會導致片狀結(jié)構(gòu)農(nóng)藥的回收率降低[21]。因此采用2.2項下不凈化的前處理方法進行了鮮鐵皮石斛20 μg·kg-1的添加回收實驗(n=3)，結(jié)果表明20 μg·kg-1添加水平下不凈化即可滿足大多數(shù)(138個)農(nóng)藥回收率在60%～120%，且方法靈敏度高，更具有操作簡便、快速、經(jīng)濟節(jié)約等優(yōu)點，因此確定的樣品前處理方法為無需凈化的方法。

另外，本研究為降低基質(zhì)效應的影響，采用了空白樣品基質(zhì)提取液來稀釋農(nóng)藥對照品溶液，測定時可使樣品溶液和對照品溶液的離子化條件更加接近，從而確保分析結(jié)果的準確可靠。

4 結(jié)論

本研究建立了鐵皮石斛藥材中141種農(nóng)藥及其代謝物殘留快速檢測的HPLC-MS/MS方法，經(jīng)驗證該方法操作簡便、靈敏度高、選擇性好，為鐵皮石斛藥材中多類別農(nóng)藥殘留的例行檢測、風險評估等研究提供了一種高效、可靠的分析手段。