閆加鵬 張洪飛 韓桂全

( 濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科 ， 山東 濰坊 261041 )

骨肉瘤來源于間葉組織，好發(fā)于長干骨如股骨遠端、脛骨和肱骨的骨骺端。骨肉瘤多見于兒童和青少年，約有3 / 1000000的發(fā)病率[1]。骨肉瘤的發(fā)展是個復(fù)雜的、多步驟的、多因素參與的過程[2]，腫瘤干細胞及其潛在性導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生，這也提示遺傳因素在骨肉瘤的發(fā)展過程中起著重要的作用[3-4]。研究證實，腫瘤的潛在侵襲性與血管內(nèi)皮細胞中新生的血管有關(guān)[5-6]，血管內(nèi)皮生長因子及新生血管的形成是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一個基本步驟[7]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種強效的促血管生長因子，VEGF的多態(tài)性可以通過改變內(nèi)部的轉(zhuǎn)錄和翻譯來影響該基因的表達[8]，一些單核苷酸多態(tài)性比如-2578C/A、936C/T和460T/C被證實可以影響VEGF蛋白的合成。越來越多的研究證實VEGF多態(tài)性和腫瘤之間的關(guān)聯(lián)性[9-11]，但目前只有2個研究報道了VEGF基因與骨肉瘤患病風險性之間的關(guān)聯(lián)[12-13]。本研究旨在探索VEGF-2578C/A, +936C/T 和-460T/C基因多態(tài)性在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中表達水平的變化?，F(xiàn)報告如下。

資料與方法

1 一般資料：本課題將濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院自2014年1月-2017年1月的90例骨肉瘤患者和90例年齡和性別無差異的健康對照組成員納入本研究進行研究分析。所有的骨肉瘤患者都是初次患病，由2位病理學(xué)醫(yī)生分別進行了確診，從臨床和病理兩方面來獲取骨肉瘤患者資料，其中包括性別、年齡、腫瘤分期、腫瘤部位、腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤家族史。對照組成員為我院健康體檢的志愿者，均為非骨肉瘤患者，且自身沒有任何癌癥病史，無一級親屬骨肉瘤患病家族史。本研究方案經(jīng)由濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準通過，根據(jù)赫爾辛基宣言對所有參與者簽署書面知情同意書。

2 研究方法：用DNA提取試劑盒從外周血白細胞中提取DNA，PCR-RFLP法來研究VEGF-2578C/A，936C/T和460T/C基因多態(tài)性表達差異。通過分子檢測3.1軟件來為VEGF-2578C/A，936C/T和460T/C設(shè)計PCR引物。PCR反應(yīng)的步驟如下：在Perkin-Elmer 9700的熱循環(huán)儀里進行94°C下8分鐘的初始變性，然后在94°C下 30秒內(nèi)進行30個周期變性，在60°C退火30秒，在72°C 下進行1分鐘延伸。PCR產(chǎn)物被NlaIII限制性內(nèi)切酶(紐英倫公司，貝弗利，MA)進行酶解。由此產(chǎn)生的DNA片段，經(jīng)3.5%瓊脂糖凝膠下進行電泳，經(jīng)過ethidum染色，在可視化的紫外線照射下透視。

3 統(tǒng)計學(xué)分析：使用SPSS 16版統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，連續(xù)變量之間的差異采用t檢驗評估，分類變量之間均采用皮爾遜x2檢驗來評估。對照組中VEGF-2578C/A,+936C/T 和 -460T/C基因多態(tài)性的哈代-溫伯格均衡參數(shù)用皮爾遜x2檢驗。組間的基因型頻率存在的差異則用皮爾遜x2檢驗手段、比值比(OR)和95%可信區(qū)間(CI)來評估。P值<0.05具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

4 結(jié)果：骨肉瘤患者和對照組的特性，見表1。觀察組和對照組之間在年齡(P = 0.69)、性別(P = 1)、腫瘤家族史(P = 0.44)方面無統(tǒng)計學(xué)差異，其中骨肉瘤組平均年齡為(21.3±11.5)歲，對照組平均年齡為(21.2±11.9)歲。觀察組中68.89%的骨肉瘤發(fā)生在長管狀骨，其余31.11%位于軀干中軸骨骼；38.89%的骨肉瘤組患者出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移，其余的61.11%患者未發(fā)生轉(zhuǎn)移。對照組的VEGF-2578C/A和460T/C基因頻率在哈迪-溫伯格平衡參數(shù)內(nèi)，但936C/T基因型頻率不在哈迪-溫伯格平衡參數(shù)內(nèi)，見表2。對照組中的VEGF-2578C/A，936C/T和460T/C的次要等位基因頻率(MAF)與中國大眾人口NCBI數(shù)據(jù)庫中的相一致。同-2578C/A的 CC基因亞型相比，-2578C/A 的AA基因型(OR = 1.90；95%可信區(qū)間 = 1.00-3.78)和CA+AA基因型(OR = 1.53；95%可信區(qū)間 = 1.00-2.25)在骨肉瘤風險中是顯著增加的，見表3。+936C/T和-460T / C基因多態(tài)性與骨肉瘤風險之間的關(guān)聯(lián)性并沒有顯著的意義。

表1 骨肉瘤患者和對照組的對比

表2 VEGF-2578C/A, +936C/T and -460T/C基因型

1MAF: 次要等位基因;2HWE: 哈迪-溫伯格平衡參數(shù)。

表3 VEGF-2578C/A, +936C/T and -460T/C基因多態(tài)性與骨肉瘤風險性的關(guān)系

討 論

遺傳因素和某些導(dǎo)致DNA損傷與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[14]，VEGF基因被認為是其中的一個重要遺傳因素[12、13]。本研究旨在探索VEGF基因多態(tài)性與國人骨肉瘤風險之間的關(guān)聯(lián)性，證實了-2578C/A的AA基因型和CA+AA基因型與骨肉瘤風險增加有關(guān)。新的血管生成在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，而血管內(nèi)皮生長因子是血管生成的關(guān)鍵因子，它能促進內(nèi)皮細胞增殖和改變血管細胞外基質(zhì)[15]。研究證實，在多種腫瘤中都有血管內(nèi)皮生長因子的高度表達，并且它與促進腫瘤組織血管密度呈正相關(guān)[16]。血管內(nèi)皮生長因子的基因多態(tài)性被證實與乳腺癌、肺癌、大腸癌、胃癌和前列腺癌等多種腫瘤的敏感性有關(guān)。目前僅有2個針對VEGF基因多態(tài)性與骨肉瘤風險性之間關(guān)聯(lián)性的研究，Tie[12]將單核苷酸與骨肉瘤的患病率之間相關(guān)性進行了研究分析，證實了VEGF-2578C/A和-634G / C的多態(tài)性可能增加骨肉瘤患病率。Wang[13]等人發(fā)現(xiàn)VEGF基因中的3個常見單核苷酸多態(tài)性對于骨肉瘤的敏感性有著潛在影響，認為-634G/C 的T等位基因可能與中國人群的骨肉瘤多態(tài)性有關(guān)，但這都需要進一步的研究來證實。

本研究證實VEGF-2578C/A的AA和CA基因亞型可能增加了國人骨肉瘤的患病率，血管生長因子在骨肉瘤病因?qū)W中可能起著重要的作用。