楊紹麗　吳仁鋒

摘要：從武漢市番茄大棚番茄葉片和果實(shí)上分離出引起番茄葉斑病和果斑病的病原真菌，對(duì)該菌進(jìn)行了病原菌鑒定和生物學(xué)特性研究。結(jié)果表明，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、致病性測定及分子鑒定該病原菌為多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）。對(duì)該菌株生物學(xué)特性研究表明，該病原菌喜光照，最適宜生長的溫度為25～30 ℃，生長適宜pH為7～9，喜歡弱堿性生長環(huán)境，供試5種碳源中葡萄糖的利用效果最好，5種氮源中硝酸鉀利用效果最好。

關(guān)鍵詞：番茄葉斑病;番茄果斑病;多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）;生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)：S436.411? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）22-0104-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.22.023? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Pathogen identification and biological characteristics of pathogens of

tomato leaf spot and fruit spot disease

YANG Shao-li，WU Ren-feng

（Institute of Vegetable，Wuhan Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430065，China）

Abstract： Pathogenic fungi causing tomato leaf spot and fruit spot disease were isolated from tomato leaves and fruits in greenhouse of Wuhan city. The pathogen identification and biological characteristics were studied. The results showed that the pathogen of tomato leaf spot and fruit spot disease was identified as Corynespora cassiicola by morphological observation， pathogenicity determination and molecular identification. The biological characteristics of the strain showed that the pathogen liked light， the optimum temperature for growth was 25～30 ℃， the optimum pH was 7～9， and the weak alkaline growth environment was preferred. Among the five carbon sources， glucose had the best utilization effect， and potassium nitrate had the best utilization effect among the five nitrogen sources.

Key words： tomato leaf spot; tomato fruit spot disease; Corynespora cassiicola; biological characteristics

多主棒孢霉[Corynespora cassicola（Berk. &

Curt.）]，屬于一種真菌。近幾年由該病菌引起的蔬菜病害在中國的一些地方肆虐，蔬菜產(chǎn)量損失嚴(yán)重[1]。據(jù)報(bào)道，該菌主要侵染黃瓜、西瓜、甜瓜、番茄、茄子、豇豆、大豆、扁豆、紫蘇、蓮藕等多種蔬菜[2-7]。比較常見的蔬菜寄主有黃瓜、豇豆和茄子，番茄上主要在北方和海南有報(bào)道[1，2]，而在武漢未見報(bào)道。于2017年和2018年5—6月，對(duì)試驗(yàn)地番茄進(jìn)行病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其葉上有病斑，并且有些成熟果實(shí)上也有黑褐色斑，且濕度大時(shí)還有黑色霉?fàn)钗锂a(chǎn)生。發(fā)病初期呈深褐色小圓點(diǎn)，病斑周圍有淺黃色暈圈，逐漸擴(kuò)展至輪紋狀大斑，或葉緣處形成半圓形病斑，黑褐色，病斑凹陷，病健界限明顯，葉片背面和正面發(fā)病癥狀相似，后期病斑可連接成片，導(dǎo)致葉片干枯。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病害在番茄生產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍，發(fā)病率通常在15%～25%，重者可達(dá)50%以上。由于該癥狀同番茄早疫病葉片上癥狀相似，容易混淆，為明確該病的病原菌，為病害診斷和防治提供理論依據(jù)，對(duì)引起該病害的病原物進(jìn)行了分離、鑒定以及病原生物學(xué)特性研究。

1? 材料與方法

1.1? 病原分離鑒定

1.1.1? 病原菌的分離和純化? 2017年和2018年5—6月在夏番茄大棚里發(fā)現(xiàn)番茄葉片及果實(shí)上出現(xiàn)黑色病斑，且數(shù)量較多。葉片上癥狀同番茄早疫病后期癥狀相似。采用常規(guī)組織分離法[8]：取病斑典型的新鮮葉片和果實(shí)，無菌水沖洗干凈，切取病健交界處的組織，先用0.1%氯化汞消毒1～2 min，再用75%乙醇消毒1 min左右，最后用無菌水清洗3次，每次1 min。消毒完成后，吸干組織表面水分，再將可能被殺死的組織剪去，剪成小塊，每皿3～5塊，接在PDA平板上，置于25 ℃恒溫箱中黑暗條件下培養(yǎng)。待其上長出菌落后，用挑取菌落邊緣菌絲以及單孢分離的方法純化和轉(zhuǎn)接培養(yǎng)病原菌。將純化的病原菌培養(yǎng)7 d后，觀察記錄菌落形態(tài)，同時(shí)將純化的病原菌轉(zhuǎn)至斜面上低溫保存。

1.1.2? 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察? 待分離純化的病原菌在培養(yǎng)基平板上產(chǎn)孢后，挑取病原菌在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)特征，測量并記錄病原菌菌絲、分生孢子梗、分生孢子等特征，并對(duì)病原菌形態(tài)特征以及菌落形態(tài)進(jìn)行數(shù)碼拍照。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，確定病原菌的分類地位。

1.1.3? 致病性測定? 按照柯赫氏法則[8]對(duì)分離到的病原菌進(jìn)行致病性測定。將分離純化的病原菌轉(zhuǎn)至PDA培養(yǎng)基平板上，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7～10 d，用無菌水將病原菌配制成濃度為1×106個(gè)孢子/mL的菌懸液。采用傷口噴霧法，用滅菌的針頭把健康的番茄葉片和果實(shí)刺傷，將配好的孢子懸浮液噴在傷口上。設(shè)5個(gè)重復(fù)，以噴清水處理作對(duì)照，把接種后的葉片和果實(shí)置于26～28 ℃培養(yǎng)箱中，定期保濕，待發(fā)病后調(diào)查記錄發(fā)病情況，從發(fā)病組織進(jìn)行再次分離，如果分離出的病原菌與接種菌形態(tài)相同，并且發(fā)病癥狀和采集癥狀一致，則可確定分離到的病原菌即為引起該病害的致病病原菌。

1.1.4? 病原菌的分子鑒定? 收集在鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板上25 ℃培養(yǎng)8～10 d的病原菌菌絲體，采用CTAB法提取病原菌基因組DNA[9]。用rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAA

CCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATAT

GC-3′）擴(kuò)增分離菌株的ITS和5.8S rDNA。進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25 μL）為10×PCR buffer（含Mg2+）2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，10 μmol上游引物0.5 μL，10 μmol下游引物0.5 μL，1 μL模板DNA，18.8 μL ddH2O。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察到預(yù)期的條帶后，將PCR產(chǎn)物送武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司進(jìn)行純化和測序。測序后的序列與GenBank中相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)分析，以確定菌株類別。

1.2? 病原菌的生物學(xué)特性研究

1.2.1? 光照對(duì)病原菌菌絲生長的影響? 將PDA平板上培養(yǎng)7 d的菌株沿菌落邊緣用打孔器取直徑4 mm的菌絲塊，接種于PDA平板中央。置于25 ℃

HP250GS型智能人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)置連續(xù)黑暗、12 h光暗交替、連續(xù)光照3個(gè)處理（光源為普通日光燈18 W，22 cm），每個(gè)處理3次重復(fù)，7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.2? 溫度對(duì)菌絲生長的影響? 將PDA平板上培養(yǎng)7 d的菌株沿菌落邊緣用打孔器取直徑4 mm的菌絲塊，接種于PDA平板中央。分別置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)，6 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.3? pH對(duì)菌絲生長的影響? 用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基中的pH分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。在不同pH的平板上接種直徑為4 mm的菌絲塊，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)，6 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.4? 碳、氮源對(duì)菌絲生長的影響? 以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基[8]。用含碳量相同的葡萄糖、可溶性淀粉、甘露醇和甘油代替其中的30.0 g蔗糖，以不加碳作對(duì)照。用含氮量相同的硝酸銨、氯化銨、尿素、硫酸銨代替其中的2.00 g硝酸鉀，以不加氮作對(duì)照。取直徑為4 mm的菌絲塊，接種在不同碳、氮源平板中央，每處理3次重復(fù)。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 病樣癥狀和病原分離

番茄葉片上，病斑大小不一，大的病斑直徑近10 mm，小的病斑直徑僅有1～2 mm;病斑的形狀變化也較大，多為近圓形、多角形、不整齊形;病斑為黑褐色，周圍具有黃色暈，有明顯輪紋，后期病斑連成片（圖1A）;發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，植株下部葉片全部枯死脫落。病斑也可擴(kuò)展到莖和果實(shí)上，形態(tài)與葉片上相似（圖1B）。連續(xù)兩年采集病樣進(jìn)行鏡檢及分離，均能分離到多主棒孢屬真菌且形態(tài)一致（圖1C）。以2018年分離果實(shí)上菌株FQG為代表菌株進(jìn)行鑒定以及后續(xù)試驗(yàn)研究。

2.2? 致病性測定

經(jīng)侵染回接試驗(yàn)，有傷接種番茄果實(shí)，接種后7 d左右開始發(fā)病（圖2A），發(fā)病率為100%。有傷接種的病情嚴(yán)重，發(fā)展較快，對(duì)照未發(fā)?。▓D2B）。接種發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀基本一致。對(duì)回接發(fā)病果實(shí)進(jìn)行再分離，仍能分離得到病原菌，說明分離病原物為致病菌。

2.3? 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

病原分離物在PDA培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)，菌落平、致密，呈輻射狀展開，邊緣規(guī)則，氣生菌絲絨毛狀，灰色（圖3A）。菌絲淡褐色，有隔膜，分枝。分生孢子梗淡褐色，直立單生，略有曲折或彎曲，不分枝，具隔膜，分生孢子梗有層出現(xiàn)象，大小多為（90～210） μm×（3～5） μm。分生孢子淺褐色，壁平滑，倒棍棒形，頂端鈍圓，直或彎曲，具有假隔膜3～10個(gè)，孢子長38.6～195.5 μm，寬5.2～18.5 μm。孢子幼時(shí)單生或串生（圖3B、圖3C）。

通過對(duì)PDA培養(yǎng)基上菌落培養(yǎng)形態(tài)、菌絲、分生孢子、分生孢子梗等形態(tài)的描述，這些特征與文獻(xiàn)[1-6]報(bào)道的關(guān)于多主棒孢霉的描述基本一致，初步確定引起該番茄葉片及果實(shí)病害的病原為多主棒孢霉。

2.4? rDNA-ITS序列分析

PCR擴(kuò)增病原菌株FQG總DNA的ITS序列，獲得一段長度約559 bp的DNA片段。將測序后的結(jié)果與GenBank中的基因序列進(jìn)行比對(duì)，與其同源性最高的ITS序列菌株均為多主棒孢霉真菌，進(jìn)一步證明引起番茄葉片和果實(shí)上病斑的病原物是多主棒孢霉。

菌株FQG 18S rDNA-ITS序列如下：

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATC

GTAGGGGCCTCGCCCCCTT CGAGATAGCACCCTTT

GTTTATGAGCACCTCTC GTTT CCTCGGCAGGCTCG

CCTGCCAACGGGGACC CACC ACAAACCCATTGTA

GTACAAGAAGTACACGTCTG AACAAAACAAAACA

AACTATTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTT

CTGGCATCGATGAAGAAC GCAGCGAAATGCGATA

AGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGA

ATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCTT

AGGGCATGCCTGTTCG AGCGTCATTTCAACCCTCA

AGCCTAGCTTGGTGTT GGGCGT CTGTCCCGCCTCC

GCGCGCCTGGACTCGCCTCAAAAGCATTGGCGGCC

GGTTCCCAGCAGGCCACGAGCGCAGCAGAGCAAG

CGCTGAAGTGGCTG CGGGTCGG CGCACCATGAGC

CCCCCCACAC CAGAATTTTGACCTCGGATCAGGTA

GGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCG

GAGGA。

2.5? 病原菌生物學(xué)特性

2.5.1? 光照對(duì)菌絲生長的影響? 病原菌在PDA平板培養(yǎng)7 d，在連續(xù)黑暗、12 h光暗交替、連續(xù)光照3種條件下，菌落平均直徑分別為66.3、73.7、79.0 mm（圖4），差異不大，但有光照的條件下，菌絲生長較快，說明光照對(duì)菌絲生長有一定的促進(jìn)作用。

2.5.2? 溫度對(duì)菌絲生長的影響? 由圖5可以看出，在PDA平板上不同溫度條件下生長8 d，病原菌菌落直徑差異明顯，說明溫度對(duì)病原菌的生長影響很大。病原菌菌絲在10～35 ℃下均能生長，適宜溫度為25～30 ℃，30 ℃時(shí)，8 d時(shí)菌落直徑最大達(dá)75.3 mm，隨著溫度再升高，生長開始受到抑制，生長緩慢。5 ℃以下及40 ℃以上時(shí)，菌絲停止生長。

2.5.3? pH對(duì)菌絲生長的影響? 由圖6可以看出，在PDA平板上，病原菌菌絲在pH 4～12時(shí)均可生長，適宜生長的pH為7～9，其中在pH為9時(shí)菌絲生長最快，6 d時(shí)菌落平均直徑為61.2 mm，當(dāng)pH為3時(shí)菌絲停止生長，而在pH為12時(shí)菌落平均直徑仍有51.8 mm，說明該菌最適合在偏堿環(huán)境條件下生長。

2.5.4? 碳、氮源對(duì)菌絲生長的影響? 由表1可以看出，病原菌能夠利用多種碳源和氮源，其中以葡萄糖作碳源最有利于菌絲生長，7 d時(shí)菌落直徑達(dá)到58.0 mm，其次是甘露醇，可溶性淀粉最差;以硝酸鉀作氮源最利于菌絲生長，7 d時(shí)菌落直徑達(dá)到44.8 mm，硫酸銨利用效果最差。

3? 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)采集武漢市大棚番茄葉斑病和果斑病樣本，對(duì)分離病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，柯赫氏法則證明試驗(yàn)及DNA序列分析表明，引起此次番茄葉片和果實(shí)病害的病原菌為半知菌亞門多主棒孢霉。

研究結(jié)果表明，武漢市番茄葉片和果實(shí)上分離到的多主棒孢霉菌株在光照下菌絲生長最快，光照利于菌絲生長，與裴月玲等[10]和陳旭玉等[11]報(bào)道的多主棒孢霉分離物對(duì)光照利用較一致。該菌菌絲在10～35 ℃下均能生長，適宜溫度為25～30 ℃，最適溫度30 ℃。該菌株菌絲在pH 4～12均可生長，最適生長的pH為7～9，與裴月令等[10]和陳旭玉等[11]報(bào)道的有差別，與劉志恒等[4]研究結(jié)果相近;該菌株更偏好于堿性環(huán)境，在pH 9時(shí)仍能良好生長且最快而后降低。本研究中病原菌能夠利用多種碳、氮源，碳源以葡萄糖利用效果最好，在氮源利用上以硝酸鉀最有利于菌絲生長。不同來源的菌株之間存在差別，多主棒孢霉的寄主范圍較廣，在種植上應(yīng)避免種間相互交叉感染，以防止進(jìn)一步加大為害。

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