常宇桐,羅云敬,*,錢承敬,楊永壇,*,史曉梅

(1.北京工業(yè)大學 生命科學與生物工程學院,北京 100124;2.中糧營養(yǎng)健康研究院 營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室/老年營養(yǎng)食品研究北京市工程實驗室，北京 102209)

白酒，又稱燒酒，是中國傳統(tǒng)的蒸餾酒[1]。中國的蒸餾白酒歷史長久，傳統(tǒng)工藝精湛，風格特征典型，產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)異，深受國內(nèi)外消費者喜愛，中國的白酒與白蘭地、威士忌、伏特加、朗姆酒和金酒并稱為世界著名的六大蒸餾酒[2]。乙醇和水是白酒的主要成分，而白酒中的微量成分，卻是決定白酒風味的關鍵。馥郁香型是“酒鬼酒的獨創(chuàng)”，兩香為兼，三香為馥，在保持原有風格的基礎上，融“瀘型之濃香、汾型之清香、茅型之醬香”于一體，一口之間，可品出前濃、中清、后醬[3]。

液液萃取技術(liquid-liquid extraction technique，LLE)開始于19世紀60年代，此技術是依據(jù)相似相溶的原理實現(xiàn)的[4-5]。范文來等[6]應用液液萃取結合正相色譜技術，采用氣相色譜結合質(zhì)譜，從清香型汾酒與醬香型郎酒中檢測到1500個峰，鑒定出698種揮發(fā)性成分，其中含有酯類物質(zhì)167種，醇類物質(zhì)67種，醛類物質(zhì)33種，酮類物質(zhì)48種，縮醛類物質(zhì)18種，有機酸34種等。全二維氣相色譜(comprehensive two dimensional gas chromatography，GC×GC)是把分離機理不相同但又相互獨立的兩根色譜柱通過串聯(lián)的方式進行結合而成的氣相色譜[7-10]。周慶伍等[11]應用全二維氣相色譜- 飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC×GC- TOF/MS)結合頂空固相微萃取技術(HS- SPME)首次全面剖析了古井貢酒中的揮發(fā)性風味成分，共鑒定出包含醇類、酸類、酯類、醛酮類物質(zhì)以及包括健康功能成分在內(nèi)的揮發(fā)性風味成分800多種。

本研究采用液液萃取技術，結合全二維氣相色譜- 四極桿質(zhì)譜，對白酒中揮發(fā)性成分進行定性和定量分析，并與一維色譜分析結果進行對比，以期為白酒在生產(chǎn)與勾兌過程中控制其風味提供理論與實踐指導。另外，結合主成分分析的分析方法，對不同等級的馥郁香型白酒進行分類，以期為白酒勾兌后等級評定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

GC/MS- QP2010 Ultra型全二維氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；一維數(shù)據(jù)采集由GC- MS solution 2.5軟件完成，二維數(shù)據(jù)分析由GC Image R 2.7軟件完成。

乙醚、氯化鈉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；乙醇、正己烷，色譜純，美國Fisher公司；76種風味物質(zhì)標準品，北京振翔科技有限公司?；旌蠘藴嗜芤旱呐渲茫悍謩e取100 μL質(zhì)量濃度為10 000 mg/L的單體標準品用乙醇定容至10 mL，作為標準儲備液，密封后置于4 ℃保存。

市場上某品牌10年陳釀68°馥郁香型基酒，某酒廠提供；市場上某品牌的三類馥郁香型白酒各4瓶，北京某大型超市。

1.2 氣相色譜和質(zhì)譜條件

一維色譜柱：Rtx- WAX型色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，日本島津公司；二維色譜柱：BPX- 5型(2.5 m×0.1 mm×0.1 μm),日本島津公司。進樣口溫度250 ℃；恒線速度操作模式；進樣量為1 μL，分流比10∶1；程序升溫：初始溫度40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。

四極桿質(zhì)譜：電子轟擊離子源(electron ionization,EI);采集方式全掃描Scan；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；采樣頻率33 Hz；質(zhì)量掃描范圍35～320 u，溶劑延遲時間3.5 min；調(diào)制周期4.2 s，熱噴時間350 ms。

1.3 樣品前處理

液液萃取：取10 mL酒樣于50 mL離心管中，將酒樣用去離子水稀釋至乙醇體積分數(shù)為30%，NaCl攪拌至溶液飽和。然后依次用5 mLV(乙醚)∶V(正己烷)=2∶1溶劑萃取2次，每次10 min，3 000r/min，離心5 min后取上層溶液，合并醚烷萃取液，氮吹濃縮至1 mL，制得樣品溶液，供全二維氣相色譜- 質(zhì)譜分析。

1.4 實驗數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)分析與處理采用美國Zoex公司開發(fā)的GC Image R2.5全二維數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行，識別信噪比大于120的色譜峰后進行自動積分和質(zhì)譜庫比對，質(zhì)譜庫為NIST MS Search 2.0，所有比對結果導出生成“峰表”[12]?！胺灞怼苯?jīng)過進一步與標準品對比驗證及人工解譜后作為初步鑒定結果。最后去除烷烴類等對風味沒有貢獻的化合物，選擇正相相似度大于800，反相相似度大于800的化合物作為最終定性結果。風味物質(zhì)定量計算方法為：面積歸一化法，即該物質(zhì)峰面積與總峰面積的比值，同時與GC- FID測絕對含量的數(shù)據(jù)進行比較，以確定數(shù)據(jù)的準確性。文中閾值根據(jù)文獻[13]的研究方法，由5名酒廠的專業(yè)品評師組成并測定。主成分分析采用SPSS 24.0軟件進行。

2 結果與討論

2.1 GC×GC- MS條件優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇

為了獲得最大的峰容量和分離度，對GC×GC- MS中的色譜柱系統(tǒng)進行了優(yōu)化，主要選擇了2種柱系統(tǒng)進行優(yōu)化，方案1中一維為極性柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)Rtx- WAX色譜柱，二維為非極性柱(2.5 m×0.1 mm×0.1 μm)BPX- 5色譜柱；方案2中一維為非極性(30 m×0.25 mm×0.25 μm)Rtx- 1色譜柱，二維為中等極性柱(2.5 m×0.1 mm×0.1 μm)BPX- 50色譜柱。白酒中的風味物質(zhì)多為醇、醛、酸、酯、酮類。其中，醇、酮、酸、醛類物質(zhì)為極性物質(zhì)，酯類為弱極性物質(zhì)，全二維分離效果取決于第一根色譜柱，故一維選擇極性柱，按極性將其分開，非極性柱無法實現(xiàn)此目的。二維選擇非極性柱，其目的是將一維無法分開的物質(zhì)在二維上按沸點的不同將其再次分離，達到較好的分離效果。其分離效果見圖1，方案1的分離效果明顯好于方案2，所以，本研究最終確定的柱系統(tǒng)是方案1。

圖1 不同柱系統(tǒng)下白酒中揮發(fā)性風味物質(zhì)的分離情況Fig.1 Separation of volatile aroma components in Baijiu by different column systems

2.1.2調(diào)制器參數(shù)優(yōu)化

調(diào)制器是全二維色譜的核心部分，主要起到捕集、聚焦、再傳送的作用，調(diào)制器包括冷噴和熱噴兩個關鍵部分。從第一支色譜柱流出的分析物，首先在冷噴氣的作用下低溫凝結之后再在熱噴氣的作用下高溫脫附從而釋放到第二支色譜柱中。在全二維氣相色譜運行的過程中，冷噴氣會持續(xù)釋放，熱噴氣脈沖式噴射，前后兩次熱噴的時間間隔稱為調(diào)制周期(modulation period)，每次熱氣釋放的時間稱為熱噴時間[14]。

調(diào)制周期是調(diào)制器的重要參數(shù)，它會在很大程度上影響著物質(zhì)的鑒定和識別。為了保證一維色譜柱的分辨率，調(diào)制周期不應該過長，理論上調(diào)制周期應低于一維色譜峰寬的1/3。但是，過短的調(diào)制周期，會出現(xiàn)在一個周期內(nèi)的待測物未完全洗脫下來，下一個調(diào)制周期的樣品就已經(jīng)進入到二維色譜柱的現(xiàn)象，即“圈繞(wraparound)現(xiàn)象”[15]。在此基礎上，選擇幾個保留時間較長的化合物作為參考，根據(jù)調(diào)制周期的設定規(guī)則，最終選擇3.0、4.2、6.0 s對白酒樣品進行分析，圖2分別給出了不同調(diào)制周期下的全二維氣相色譜—四極桿質(zhì)譜分離圖。由圖2可知，調(diào)制周期為3.0 s時產(chǎn)生非常明顯的圈繞現(xiàn)象，不利于譜圖的分析；調(diào)制周期4.2 s和6.0 s時沒有此現(xiàn)象，各組分在一個周期內(nèi)調(diào)制完成，且峰型良好，分離度高，靈敏度好。在滿足分離度的條件下，盡可能選擇短的調(diào)制周期，可以減少峰展寬，保證第一根柱的正交分離，同時，減少一維色譜的柱效損失，保證保留時間的精確度，有利于定性分析[15]，因此選擇4.2 s作為較佳的調(diào)制周期。

圖2 不同調(diào)制周期下白酒中揮發(fā)性風味物質(zhì)在的二維色譜Fig.2 Slice profile of volatile aroma components in Baijiu by GC×GC under different modulation periods

2.1.3質(zhì)譜掃描質(zhì)量范圍的確定

對白酒中存在的揮發(fā)性香氣成分進行檢測和識別，需要采用全掃模式進行分析，為增加定性定量的準確度和靈敏性，需要使用盡可能高的掃描頻率。由于此次實驗使用的全二維氣相色譜是采用半導體制冷的方式，與液氮制冷的最大區(qū)別是冷凍溫度不同，半導體制冷的冷凍溫度是-90 ℃，而液氮制冷能達到的冷凍溫度是-196 ℃，其弊端是可能會導致C7以下的化合物凍不住，而不能達到很好的分離效果?？紤]到白酒中的揮發(fā)性風味成分較多且較為復雜，為保證色譜圖的完整性，起始掃描荷質(zhì)比設定為35，對于掃描荷質(zhì)比的上限，根據(jù)一維色譜的檢測經(jīng)驗，最終選擇320為掃描的最大荷質(zhì)比。在35～320 u的掃描范圍內(nèi)，當設定四極桿的掃描速率為20 000 u/s時，掃描的頻率可達33.3 Hz，保證了化合物的準確定性和定量。

2.2 馥郁香型白酒風味成分總體輪廓定性定量分析

通過全二維氣相色譜- 四極桿質(zhì)譜法得到的結果對馥郁香型白酒進行定性分析，得到它的全二維輪廓圖(圖3)。通過對其化學成分分析，結合其總離子流圖(total ion current，TIC)、標準品、NIST譜圖庫及人工解譜，以各種成分的相似度為參考，在馥郁香型白酒中共鑒定出308種匹配度較高的揮發(fā)性風味成分，其中酯類物質(zhì)102種，醇類物質(zhì)42種，酸類物質(zhì)33種，醛類物質(zhì)26種，酮類物質(zhì)19種，其他物質(zhì)86種，各類化合物的主要組成成分見表1。

圖3 馥郁香型白酒風味成分全二維輪廓圖Fig.3 Two-dimensional contour map of volatile aroma components in Fuyu flavor Baijiu

表1 GC×GC- MS鑒定出馥郁香型白酒基酒中的主要化合物Tab.1 Main compounds in Fuyu flavor Baijiu identified by GC×GC- MS

用同樣的前處理方式和儀器條件，運用GC- MS對馥郁香型白酒的揮發(fā)性風味成分進行定性分析，共鑒定出65種揮發(fā)性香氣成分，遠遠少于GC×GC- MS技術所鑒定出來的308種香氣成分，這說明GC×GC- MS具有峰容量大、靈敏度高、分辨率高等優(yōu)點，能夠?qū)⒃谝痪S色譜不能分開的物質(zhì)在二維上得到較好的分離效果，適合分析中國傳統(tǒng)白酒這種十分復雜的體系。

2.3 感官評級與色譜結果對比

目前對白酒樣品等級評定主要依靠感官品評來進行，然而，培養(yǎng)一個專業(yè)的品評師，需要花費大概2～3年的時間，且在品評過程中對環(huán)境的要求較為嚴苛，主觀性較大，會出現(xiàn)判斷不準確的現(xiàn)象，故在實際應用過程中，需要多名品評師共同進行感官品評以保證結果的準確性。因此，迫切需要尋求一種有效的化學檢測技術結合數(shù)據(jù)分析軟件對白酒進行等級評定。

運用已優(yōu)化的色譜- 質(zhì)譜條件對感官品評結果分為甲、乙、丙3個等級，每個等級的4個樣品，共12個市售馥郁香型白酒樣品進行測定(見表2)，之后利用SPSS 24.0軟件進行主成分分析，通過主成分分析可以設法將原來變量重新組合成一組新的互相無關的幾個綜合變量，同時根據(jù)實際需要從中可以取出幾個較少的綜合變量盡可能多地反映原來變量的信息[16]。對所測結果進行分析，選擇12個樣品的62個共有峰。由于本實驗為市售的成品酒，是基酒進行勾兌和稀釋后得到的，故所測出來的揮發(fā)性香氣成分沒有基酒中多，又由于不同等級的成品酒中的揮發(fā)性香氣成分及其含量有所區(qū)別，所以此處定性定量檢測到62個共有峰。

表2 馥郁香型白酒樣品組成Tab.2 Compositions in Fuyu flavor Barjiu

將62個共有峰經(jīng)過有限次剔除后共保留了14個共有峰(見表3)，再用上述14個共有峰進行主成分分析，主成分分析結果見表4，從表4可以看出，前4個主成分的累積貢獻率92.27%，基本反映了原指標的信息。表4中4個彼此不相關的綜合指標涵蓋了刪減后14個共有峰的信息，并且它們所代表的信息不重疊。

將選出的14個共有峰數(shù)據(jù)進行主成分分析后，以其第二主成分的得分對第一主成分的得分做散點圖即可得到所有樣本的PCA投影圖。圖4為3等級12個樣品在這6個主要特征值上的得分投影圖。由圖4可見，運用上述方法結合主成分分析，能夠?qū)ビ粝阈桶拙七M行分類，且所得結果與感官品評結果完全一致，表明該方法對不同等級馥郁香型白酒的判別是可行的。

表3 馥郁香型白酒揮發(fā)性香氣成分中的共有化合物Tab.3 Common volatile compounds in Fuyu flavor Baijiu

表4 6個主成分的特征值、貢獻率和累積貢獻率Tab.4 Eigenvalue,contribution rate and cumulative contribution rate of 6 principal components

圖4 主成分分析后的PCA投影圖Fig.4 Projection plot of principal component analysis

3 結 論

采用液液萃取結合全二維氣相色譜- 四極桿質(zhì)譜技術建立了馥郁香型白酒中揮發(fā)性香氣成分的分析方法并解析了白酒中揮發(fā)性組分。研究發(fā)現(xiàn)應用極性不同的全二維色譜柱系統(tǒng)結合四極桿質(zhì)譜能夠有效實現(xiàn)白酒中復雜揮發(fā)性組分的分離與分析。與傳統(tǒng)的一維色譜相比，許多在一維色譜中沒有分離的化合物在二維色譜中均得到了較好的分離效果。運用該方法在馥郁香型白酒中共檢測到308種揮發(fā)性香氣成分，遠多于一維色譜的65種，其中，酯類物質(zhì)102種，醇類物質(zhì)42種，酸類物質(zhì)33種，醛類物質(zhì)26種，酮類物質(zhì)19種，其他物質(zhì)86種，體現(xiàn)了馥郁香型白酒揮發(fā)性香氣成分的復雜性，同時也充分證實了全二維氣相色譜具有較大的峰容量，較高的靈敏度和較高的分辨率的特點，為白酒中揮發(fā)性風味成分的分析提供了更為高級的分析手段。GC×GC- MS由于其優(yōu)越性能，能夠成為白酒揮發(fā)性風味成分檢測的重要分析方法，可以對白酒等傳統(tǒng)風味食品的揮發(fā)性風味化合物進行準確的定性和定量，更全面、準確地了解食品的特征揮發(fā)性風味物質(zhì)，為研究食品風味的特征形成機制以及品質(zhì)控制方面提供更加準確的理論依據(jù)。運用主成分分析能夠觀測到不同等級馥郁香型白酒的分類趨勢，且結果與感官品評結果一致，能夠為工廠在白酒生產(chǎn)過程中等級評定環(huán)節(jié)提供理論指導。