劉 瑞，謝辰陽，吳水霞，楊 芳，張 美

(武漢工程大學(xué) 環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430205)

核桃(JuglansregiaL.)屬斗科目胡桃科胡桃屬植物，享有世界四大堅(jiān)果之一的美譽(yù)[1]。我國(guó)是除了美國(guó)之外，核桃最大的生產(chǎn)國(guó)，在青皮核桃加工脫皮過程中，每年大約有35萬t的青皮廢料產(chǎn)生，這不僅對(duì)環(huán)境造成了污染，同時(shí)還是一種浪費(fèi)[2]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者現(xiàn)已從核桃青皮中提取分離出大量化學(xué)物質(zhì)，其有效化學(xué)成分主要有萘醌類、多酚類、多糖、二芳基庚烷類等[3]。多酚在核桃青皮中的含量?jī)H次于黃酮、蒽醌類[4]，具有很強(qiáng)的抑菌、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等功效，其抗癌機(jī)理也與其抗氧化性息息相關(guān)[5-7]。研究以酚類物質(zhì)含量為指標(biāo)，采用三因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化核桃青皮酚類物質(zhì)提取工藝。采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)和質(zhì)譜法(mass spectrum，MS)研究其酚類物質(zhì)組成，以期為核桃青皮的開發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃，云南省保山市優(yōu)昊實(shí)業(yè)有限公司。

福林酚試劑，上海金穗生物科技有限公司；無水碳酸鈉、無水乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品表兒茶素、沒食子酸、原花青素、表兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV- 1800型可見光分光光度計(jì)，上海美諾達(dá)儀器有限公司；DK- S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FW100型高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；ML- 204/02型精密電子天平，梅特勒- 托利多儀器(上海)有限公司；GZX- 9030型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Agilent 1290型高效液相儀、Agilent 1100 LC- MS/TOF高分辨液相質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1核桃青皮酚類物質(zhì)提取工藝

核桃青皮去雜、清洗、干燥后粉碎，過40目篩。稱取2 g核桃青皮粉，加入乙醇- 水混合溶劑，水浴恒溫提取，將混合液真空抽濾，收集濾液[8]。

1.3.2核桃青皮多酚含量測(cè)定

1.3.2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[9]，在0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL的0.1 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液中，加入1 mL福林酚試劑和2 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%Na2CO3溶液，然后加入不同體積的蒸餾水定容至10 mL。搖勻后避光反應(yīng)1 h，765 nm測(cè)定其吸光度，重復(fù)3次。得到?jīng)]食子酸質(zhì)量濃度(X)與吸光度(Y)的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為Y=13.903X+0.059，R2=0.991。

1.3.2.2 酚類物質(zhì)含量計(jì)算

將核桃青皮酚類物質(zhì)提取物稀釋一定倍數(shù)，取1 mL待測(cè)樣品溶液于試管，加入1 mL福林酚試劑，搖勻后滴加2 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)12% Na2CO3溶液和1 mL蒸餾水。搖勻后在25 ℃下避光反應(yīng)1 h，765 nm測(cè)定其吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)回歸方程得到酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度ρ，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，酚類物質(zhì)含量計(jì)算見式(1)：

(1)

式(1)中，w為酚類物質(zhì)含量，mg/g；ρ為待測(cè)樣品中酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為核桃青皮質(zhì)量，g。

1.3.3核桃青皮酚類物質(zhì)提取工藝優(yōu)化

在前期單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)確定核桃青皮中酚類物質(zhì)的優(yōu)化提取條件[10]，以酚類物質(zhì)提取率為指標(biāo)，每組稱取2 g核桃青皮，設(shè)定提取時(shí)間為120 min，采用L9(33)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)如表1。

1.3.4核桃青皮酚類物質(zhì)的分級(jí)純化

采取液- 液萃取方法，將核桃青皮酚類物質(zhì)粗提物用適量水溶解，經(jīng)石油醚(體積比1∶3)、二氯甲烷(體積比1∶1)、乙酸乙酯(體積比1∶1)依次各萃取3次后，利用溶液極性不同(極性由大到小依次為水、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚)，可將多酚粗提物按梯度初步分開。收集水層及乙酸乙酯層，分別制備極性最強(qiáng)的水溶性酚類物質(zhì)和極性略低的乙酸乙酯層提取物[11-12]。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.5核桃青皮酚類物質(zhì)的組成分析

1.3.5.1 高效液相色譜分析

將表兒茶素、沒食子酸、鞣花酸和原花青素等物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品加去離子水溶解，分別配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

將核桃青皮酚類物質(zhì)粗提物溶液稀釋到1.0 mg/mL。同標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制方法，配制1.0 mg/mL的乙酸乙酯層樣品以及1.0 mg/mL的水層樣品[13]。

原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線：根據(jù)不同的原花青素峰面積(y)以及對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(x)繪制曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為y=890.004 8x+7.900 2。

色譜條件：色譜柱DIONEX C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.05%三氟乙酸，流動(dòng)相B為甲醇。梯度洗脫為0～12 min，87%～75%A，13%～20%B；12～23 min，75%～20%A，25%～80%B；23～26 min，87%A，13%B。流速為0.5 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL[14-16]。

1.3.5.2 質(zhì)譜分析

將得到的乙酸乙酯層樣品粉末1.0 mg，溶于1 mL的甲醇，通過0.22 pm濾器過濾，得到樣液，待進(jìn)樣[17]。

MS條件：色譜柱Lichrosphers C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，質(zhì)譜進(jìn)樣分流比為1∶1。負(fù)離子模式，離子化方式為ESI負(fù)離子，掃描范圍m/z50～2 000，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速15 L/min，噴霧壓力40 psi，毛細(xì)管電壓3 500 V[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Statistica program 10.0 軟件；繪圖采用Sigmaplot 10.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

提取條件為A3B2C2，即提取時(shí)間120 min，提取溫度80 ℃，料液比(g/mL)1∶15，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%條件下，核桃青皮酚類物質(zhì)的提取效果較優(yōu)，提取率為0.99%(見表2)。比較RA、RB、RC可知，提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)核桃青皮酚類物質(zhì)提取率的影響相近，且均大于料液比的影響。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal experiment

2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)正交試驗(yàn)優(yōu)化得出的提取條件進(jìn)行驗(yàn)證，稱取2 g核桃青皮粉末，按優(yōu)化工藝進(jìn)行提取，此時(shí)核桃青皮酚類物質(zhì)得率為0.99%，與預(yù)測(cè)值接近，且高于任何一次單因素實(shí)驗(yàn)。證明正交試驗(yàn)優(yōu)化法得到的提取工藝科學(xué)合理，準(zhǔn)確可靠。

2.3 核桃青皮酚類物質(zhì)高效液相色譜分析結(jié)果

對(duì)核桃青皮酚類物質(zhì)粗提物進(jìn)行高效液相色譜分析(圖1)。結(jié)果顯示，在3.133 min時(shí)有一個(gè)明顯的峰，將其與表兒茶素、沒食子酸、鞣花酸和原花青素等標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間對(duì)比，確定其為原花青素。由圖1可知，該峰面積為543.936，根據(jù)1.3.5.1節(jié)中原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線可定量分析出原花青素的質(zhì)量濃度為0.602 3 mg/mL。核桃青皮酚類物質(zhì)粗提物上樣質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，則粗提物中原花青素含量為602.3 mg/g。

圖1 酚類物質(zhì)粗提物高效液相色譜Fig.1 HPLC of crude extracts

2.4 核桃青皮酚類物質(zhì)質(zhì)譜分析結(jié)果

2.4.1乙酸乙酯層樣品質(zhì)譜分析結(jié)果

乙酸乙酯層樣品質(zhì)譜分析結(jié)果見表3，核桃青皮多酚粗提物的乙酸乙酯層中有34種化合物。根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果，結(jié)合相關(guān)資料和m/z，推斷分子式。結(jié)果顯示，乙酸乙酯層樣品中有原兒茶醛、原兒茶酸、丁香酸、鞣花酸、兒茶素或表兒茶素、皮樹脂醇、薊黃素衍生物及三?；咸烟堑任镔|(zhì)。

2.4.2水層樣品質(zhì)譜分析結(jié)果

水層樣品質(zhì)譜及化合物分子式分析結(jié)果見表4，核桃青皮多酚粗提物的水層中有25種化合物。根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果，結(jié)合相關(guān)資料和m/z推斷分子式。結(jié)果顯示，水層樣品中含有沒食子酸酰葡萄糖、皮樹脂醇以及短葉蘇木酚羧酸。

3 結(jié) 論

研究采用正交試驗(yàn)優(yōu)化核桃青皮酚類物質(zhì)提取工藝，確定核桃青皮酚類物質(zhì)的優(yōu)化提取工藝為提取時(shí)間120 min，提取溫度80 ℃，料液比(g/mL)1∶15，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%。高效液相色譜分析顯示，核桃青皮中含有原花青素，其含量為602.3 mg/g。將粗提物按極性不同分為乙酸乙酯層和水層。通過高分辨質(zhì)譜進(jìn)一步鑒定出乙酸乙酯層含有原兒茶醛、原兒茶酸、丁香酸、鞣花酸、兒茶素或表兒茶素、皮樹脂醇、薊黃素衍生物、三?；咸烟?；水層中含有沒食子酸酰葡萄糖、皮樹脂醇以及短葉蘇木酚羧酸。田平平等[19]研究表明核桃青皮中具有強(qiáng)抗氧化活性的7種主要成分為綠原酸、短葉蘇木酚羧酸、花靛- 葡萄糖/半乳糖、鞣花酸、槲皮素- 阿拉伯糖、表兒茶素或兒茶素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷，其中，鞣花酸、表兒茶素或兒茶素在本研究中也被檢出。核桃青皮多酚組成復(fù)雜，不同極性多酚的活性也不盡相同，文章研究了核桃青皮中不同極性酚類物質(zhì)的組成，為今后酚類物質(zhì)的分級(jí)利用，構(gòu)效關(guān)系研究以及開發(fā)不同用途核桃青皮系列產(chǎn)品提供了一定的參考。

表3 酚類物質(zhì)粗提物乙酸乙酯層質(zhì)荷比分析結(jié)果Tab.3 Analysis of mass to charge ratio of crude extracts in ethyl acetate layer

紫外波長(zhǎng)為254、280 nm。

表4 酚類物質(zhì)粗提物水層荷質(zhì)比分析結(jié)果Tab.4 Analysis of mass to charge ratio of crude extracts in water layer

紫外波長(zhǎng)為254、280 nm。