王曉媛，王彥兵，李澤生，李 標(biāo)，丁 剛，白燕冰,*

(1.廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，云南 瑞麗 678600；3.中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

石斛(Dendrobium)作為“藥食同源”植物，不僅具有珍貴的藥用價(jià)值，還具有較高的食用營(yíng)養(yǎng)成分[1]。石斛的生物活性成分主要有多糖、石斛堿、酚類、必需氨基酸、倍半萜類、甾體類、芪類和木質(zhì)素類等[2-5]。多糖是石斛主要活性成分之一，大量研究表明，石斛多糖具有清除自由基，提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化的能力[6-7]；石斛堿具有消炎止痛、保護(hù)神經(jīng)、抑制腫瘤活性的功效[8-9]；醇溶液性成分中含有豐富的芪類(二苯乙烯類)化合物[10]；氨基酸有一定的生理意義，起到防病保健的作用[11]。石斛在國(guó)內(nèi)外都具有很大的藥用開發(fā)價(jià)值和廣闊的藥品保健品市場(chǎng)。野生鐵皮石斛市場(chǎng)需求量較大，但目前人工繁育種植仍存在一定的限制。研究開發(fā)其他品種的石斛是緩解鐵皮石斛資源稀缺的可行性措施。研究表明，目前實(shí)際具有開發(fā)價(jià)值的石斛并不多，藥用最為廣泛的主要有鐵皮石斛(D.officinale)、金釵石斛(D.nobile)、霍山石斛(D.huoshanense)、鼓槌石斛(D.chrysotoxum)、齒瓣石斛(D.devonianum)等[2,12]，對(duì)于其他石斛的研究開發(fā)相對(duì)較少，不利于石斛的種質(zhì)資源保護(hù)。

本研究擬對(duì)石斛屬石斛組(sect.Dendrobium)6種石斛(線性石斛、蜻蜓石斛、杓唇石斛、疊鞘石斛、流蘇石斛、細(xì)葉石斛)的多糖、醇溶性成分、石斛堿和17種氨基酸的含量進(jìn)行測(cè)定，旨在了解不同種質(zhì)石斛的化學(xué)成分含量和差異，為各種石斛資源的較好利用和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

供試石斛均采自云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所石斛種質(zhì)資源圃保存的原生種石斛，詳情見表1。采集時(shí)間為2017年3月，采集部位為一年生莖段。石斛鮮條于55 ℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎后過三號(hào)篩備用。

表1 石斛樣品來源Tab.1 Source of Dendrobium samples

葡萄糖對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110833- 200904；石斛堿對(duì)照品，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號(hào)17012003；苯酚、萘(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸鈉和茚三酮為進(jìn)口試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；D- 37520型高速離心機(jī)，德國(guó)Heraeus公司；ME204型電子分析天平，上海恒勤儀器設(shè)備有限公司；G2X- 9240MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RETSCH MM400型組織磨樣器，濟(jì)南泰和盈科商貿(mào)有限公司；TGL20MW型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；Biochrom30+型全自動(dòng)氨基酸分析儀，大昌華嘉商業(yè)(中國(guó))有限公司；SN251668型生物芯片分析儀，美國(guó)伯騰公司；6890N型氣相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1多糖含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[2]測(cè)定多糖含量。選用紫外分光光度法，在488 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=0.030 1x+0.004(r=0.999 9)。根據(jù)吸光度及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品多糖(以葡萄糖計(jì))含量。

1.3.2醇溶性成分測(cè)定

參照文獻(xiàn)[2]測(cè)定醇溶性成分含量。以95%乙醇作溶劑，以干燥品計(jì)算供試品中醇溶性成分的含量。

1.3.3石斛堿含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[2]測(cè)定石斛堿含量，參照氣相色譜法測(cè)定結(jié)果[2,13]。

1.3.4氨基酸含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取石斛粉末樣品0.2 g(精確到0.000 1)，于10 mL安剖瓶中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸，測(cè)定除色氨酸以外的17種氨基酸，參照GB/T 5009.124—2003執(zhí)行[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)測(cè)定3次，取平均值，所有數(shù)據(jù)經(jīng)Origin 85和SPSS 20.0軟件分析。采用Origin 85進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及含量計(jì)算；采用SPSS 20.0進(jìn)行氨基酸主成分分析及各成分相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量分析

對(duì)石斛組6種石斛多糖含量的測(cè)定結(jié)果見表2。不同石斛的多糖含量差異較大(P<0.05)。多糖含量最高的是流蘇石斛，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.90%，最低的是蜻蜓石斛，質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為6.92%，二者相差3.9倍。所有石斛樣品均來自同一產(chǎn)地，說明該批石斛多糖含量的差異主要來自基因型的不同，結(jié)果與劉文杰等[15]研究結(jié)果一致。多糖是石斛的主要藥性成分，若以多糖含量高低衡量石斛品質(zhì)的優(yōu)良，本研究結(jié)果表明，流蘇石斛、疊鞘石斛品質(zhì)較優(yōu)。

表2 6種石斛的多糖、石斛堿和醇溶性成分的含量Tab.2 Content of polysaccharides,dendrobium alkaloids and alcohol soluble components in six species of Dendrobium %

2.2 醇溶性成分含量分析

對(duì)6種石斛的醇溶性成分含量進(jìn)行了測(cè)定(表2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6種石斛的醇溶性成分含量有顯著差異(P<0.05)。醇溶性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是線葉石斛，為13.01%，流蘇石斛質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，為3.82%。其他石斛的醇溶性成分含量差異不大，由高到低依次為杓唇石斛、細(xì)葉石斛、蜻蜓石斛、疊鞘石斛。本研究結(jié)果中，所有石斛除流蘇石斛外，醇溶性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于中國(guó)藥典(不得少于6.5%)的要求，可作為研究醇溶性成分藥性藥效實(shí)驗(yàn)的優(yōu)良材料。

2.3 石斛堿含量分析

由表2可知，6種石斛樣品僅檢測(cè)到線葉石斛中存在少量石斛堿，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.019%，低于中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)0.40%，其余石斛未檢測(cè)到相應(yīng)峰值。大量研究表明，石斛堿是金釵石斛的特征成分，目前未見其他石斛含較高含量的石斛堿。

2.4 氨基酸含量分析

2.4.1氨基酸成分和含量測(cè)定結(jié)果

6種石斛的17種氨基酸成分和含量測(cè)定結(jié)果見表3。由表3可知，氨基酸總量為3.58%～8.09%時(shí)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)由高至低依次是蜻蜓石斛、線葉石斛、流蘇石斛、杓唇石斛、疊鞘石斛、細(xì)葉石斛。所有樣品中含量最高的3種氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸和亮氨酸，蛋氨酸、胱氨酸和組氨酸含量最低。

進(jìn)一步分析6種石斛樣品中的必需氨基酸、非必需氨基酸、兒童必需氨基酸、支鏈氨基酸、藥用氨基酸以及它們分別占總氨基酸含量的比率。結(jié)果表明(表3)，所有樣品的必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.39%～3.10%，必需氨基酸占總氨基酸比率均接近40%。6種石斛除流蘇石斛外，必需氨基酸占非必需氨基酸的比率都超過了60%，其中杓唇石斛的必需氨基酸占非必需氨基酸的比率高達(dá)68.02%。根據(jù)FAO(聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織)和WHO(世界衛(wèi)生組織)提出的蛋白質(zhì)理想模式，即必需氨基酸占總氨基酸含量為40%，占非必需氨基酸含量為60%以上[16]。本研究結(jié)果表明，除流蘇石斛外，其他5種石斛均接近理想模式，說明5種石斛含有的蛋白質(zhì)是一種優(yōu)良的蛋白營(yíng)養(yǎng)來源，有較大的開發(fā)潛力。充足的兒童氨基酸(His、Arg)[17]能有效促進(jìn)孩子生長(zhǎng)發(fā)育，有利于身體健康，6種石斛中兒童氨基酸占總氨基酸比率為9.33%～16.57%。支鏈氨基酸(Val、Ile、Leu)[17]具有提高運(yùn)動(dòng)能力、緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞、減輕肌肉酸痛和增強(qiáng)免疫的優(yōu)良功效。所有石斛樣品的支鏈氨基酸占總氨基酸比率為11.74%～38.55%，占比超過25%的樣品從高至低依次是疊鞘石斛、細(xì)葉石斛和杓唇石斛。另外，所有石斛還具有豐富的藥用氨基酸(Asp、Glu、Gly、Arg、Met、Phe、Ile、Leu和Lys)[17-18]，6種石斛藥用氨基酸占總氨基酸比率均在60%以上。

2.4.2氨基酸主成分分析

將6種石斛中的氨基酸進(jìn)行主成分分析，17種氨基酸主成分得分系數(shù)矩陣及特征值見表4。前5個(gè)主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到了100%，其中第1主成分方差貢獻(xiàn)率最大，占91.05%，說明第1個(gè)主要成分在石斛組石斛氨基酸質(zhì)量評(píng)價(jià)中起主導(dǎo)作用，前5個(gè)主成分已包含17種氨基酸的全部信息。第1主成分特征值為15.48，累計(jì)貢獻(xiàn)率為91.05%，Ser、Tyr、Phe等氨基酸有較高載荷，說明第1成分主要反映了Ser、Tyr、Phe等氨基酸指標(biāo)的信息；同理，第2主成分特征值為0.93，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為96.54%，主要反映了Thr、Lys、Arg等指標(biāo)的信息；第3主成分特征值為0.37，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為98.7%，主要反映了Pro、Ile等指標(biāo)的信息；第4主成分特征值為0.16，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為99.61%，主要反映了Glu、Cys、Met、Leu等指標(biāo)的信息；第5主成分特征值為0.07，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為100%，主要反映了Asp、Gly、Ala、Val、His等指標(biāo)的信息。即前5個(gè)主成分已包含了17種氨基酸的全部信息。

表3 6種石斛的氨基酸含量Tab.3 Content of amino acid in six species of Dendrobium %

n=3；T：氨基酸總量；a：必需氨基酸總量；b：非必需氨基酸總量；c：兒童氨基酸總量；d：支鏈氨基酸總量；e：藥用氨基酸。

根據(jù)各氨基酸在不同因子上的載荷，可確定Ser、Tyr、Phe 3種氨基酸為石斛組石斛的特征氨基酸。

2.5 4種化學(xué)成分含量相關(guān)性分析

4種化學(xué)成分含量相關(guān)性分析見表5。石斛中不同的化學(xué)成分在含量上存在一定的相關(guān)性：多糖含量與醇溶性成分、氨基酸總量之間呈負(fù)相關(guān)；醇溶性成分與氨基酸相互之間呈正相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，石斛屬石斛組的6種石斛含有豐富的多糖、醇溶性成分和氨基酸，且差異顯著(P<0.05)。供試石斛來自同一產(chǎn)地，化學(xué)成分含量差異主要取決于基因型影響，這與文獻(xiàn)[11]中的研究結(jié)論一致。流蘇石斛多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.90%，高于中國(guó)藥典規(guī)定(25%)，其在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中是中藥石斛的來源之一，深入研究其化學(xué)成分和藥理活性具有重要意義。這一結(jié)果表明，種植地的環(huán)境條件、栽培模式比較適宜該種質(zhì)流蘇石斛的多糖積累。6種石斛除流蘇石斛外，醇溶性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)都超過藥典標(biāo)準(zhǔn)6.5%，豐富的醇溶性成分含量為進(jìn)一步分析其中單一成分提供數(shù)據(jù)支持。6種石斛中僅線葉石斛檢出石斛堿，且含量極低，未達(dá)到2015年版中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)。6種石斛的氨基酸種類齊全，均含有被檢測(cè)的17種氨基酸，除流蘇石斛外，其他5種石斛均接近FAO/WHO提出的理想模式。兒童氨基酸(占氨基酸總量的9.33%～16.57%)、支鏈氨基酸(占氨基酸總量的11.74%～38.55%)及藥用氨基酸(占氨基酸總量的62.41%～67.74%)等功能性氨基酸含量較為豐富。分析結(jié)果表明，6種石斛具有較高的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。6種石斛氨基酸主成分分析表明，前5個(gè)主成分已包含17種氨基酸的全部信息，可作為功能氨基酸的描述性指標(biāo)。主成分分析確定的Ser、Tyr、Phe 3種氨基酸為石斛組石斛特征氨基酸，可為進(jìn)一步建立石斛組石斛化學(xué)成分分類方法及深入研究和開發(fā)石斛組石斛提供參考依據(jù)。

表4 17種氨基酸主成分得分系數(shù)矩陣及特征值分析Tab.4 Score coefficient matrix and eigenvalue analysis of 17 amino acids

表5 6種石斛中不同化學(xué)成分的相關(guān)分析Tab.5 Correlation analysis of different chemical components in six species of Dendrobium

從植物學(xué)的角度分類，6種石斛都屬于石斛屬石斛組，然而該分類方式無法體現(xiàn)石斛中主要化學(xué)成分的差異性，不利于針對(duì)性地進(jìn)行成分分析?；瘜W(xué)成分相關(guān)性分析表明，多糖含量與醇溶性成分、氨基酸總量之間呈負(fù)相關(guān)；醇溶性成分與氨基酸之間呈正相關(guān)，該分析結(jié)果與燈籠組石斛[19]有一定差異性，說明各類群之間存在一定差異性，應(yīng)分別加以研究。石斛組6種石斛化學(xué)成分差異顯著，僅從外觀形態(tài)對(duì)石斛進(jìn)行分組存在一定局限性，其分類有待進(jìn)一步研究和探討。不同化學(xué)成分表明其藥理作用不同，應(yīng)分別進(jìn)行研究，以便科學(xué)高效地開展石斛優(yōu)良品種選育。