苗二芽 李穎波 蔡少康 吳群 蔡毅

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院疼痛科，湖北 武漢 430014

骨質(zhì)疏松癥(OP)是一種慢性骨病，是世界范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。其主要特征是骨密度低(BMD)和骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折(OF)的風(fēng)險(xiǎn)急劇增加，好發(fā)生于髖部和脊柱。髖部骨質(zhì)疏松性骨折是最具有破壞性的后果之一，具有高死亡率和致殘率[1]。據(jù)報(bào)道，美國(guó)約有200萬(wàn)男性和800萬(wàn)女性患有OP，同時(shí)估計(jì)有3 400萬(wàn)人患有骨量減少[2]。在歐洲，大約有550萬(wàn)男性和2 200萬(wàn)女性被診斷為OP[3]。在中國(guó)，患病率從2008年前的14.94%增加到2012～2015年的27.96%，這給家庭和社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。最近的研究表明，凝溶膠蛋白(GSN)水平與許多疾病有關(guān)，如乳腺癌、口腔癌、多發(fā)性硬化和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[5]。GSN還與破骨細(xì)胞的功能有關(guān)，例如，缺乏GSN表達(dá)的小鼠會(huì)導(dǎo)致骨吸收的減少和骨量和強(qiáng)度的增加[6]。一項(xiàng)臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，GSN對(duì)維持白人女性的BMD非常重要[7]。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了GSN對(duì)BMD和骨代謝的重要影響。此外，GSN具有從骨髓組織中分泌的潛在能力。尚不清楚血漿GSN是否與BMD相關(guān)及是OP的潛在生物標(biāo)志物。為了解決上述問(wèn)題，我們研究了中國(guó)人群中血漿GSN是否與人體BMD和骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物相關(guān)。

1 材料和方法

1.1 研究方案

本研究納入2017年7月到2018年6月這個(gè)時(shí)間段在我院就診的患者(>55歲)為研究對(duì)象。包括226名受試者(男性114名，年齡67.1±6.5歲；女性112名，年齡66.8±6.9歲)。所有女性都是絕經(jīng)后的女性。通過(guò)問(wèn)卷收集具體信息，例如年齡、身高、體重和病史等。對(duì)于全部受試者(A組)，按照是否患有骨質(zhì)疏松癥分為骨質(zhì)疏松癥組(OP組，BMDT評(píng)分≤-2.5)和BMD正常組 (NBMD組，BMDT評(píng)分≥-1)兩組；隨后將所有女性按照是否年齡超過(guò)70歲分為小于70歲組(B組)和大于70歲組(C組)兩組；為了盡量減少對(duì)骨量的潛在混淆影響，嚴(yán)格按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選取受試者。排除包括涉及重要器官(如心臟、肺、肝、腎和腦)的慢性疾病、嚴(yán)重的代謝性疾病(如糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)或甲狀旁腺功能亢進(jìn))和其他骨骼疾病(如佩吉特)疾病和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，長(zhǎng)期使用影響骨代謝的藥物(如皮質(zhì)類(lèi)固醇治療和抗驚厥藥物)患者。該研究獲取醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。每位受試者均簽署知情同意書(shū)。

全髖BMD值(g/cm2)通過(guò)使用雙能X射線(xiàn)骨密度儀(DXA，美國(guó)Hologic公司)測(cè)量股骨頸、大轉(zhuǎn)子和轉(zhuǎn)子間的BMD值，所有DXA測(cè)量均由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的操作員執(zhí)行。髖部骨密度的變異系數(shù)為2.49%。在早晨7:00～9:00抽取每個(gè)受試者靜脈血，并通過(guò)離心提取血漿并將其保持在-80 ℃冰箱中供以后使用。通過(guò)自動(dòng)分析儀測(cè)量血漿葡萄糖、總膽固醇和三酰甘油的水平。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)定血漿凝溶膠蛋白(GSN)水平。通過(guò)ELISA(FeikangBiotec, Guangzhou, China)測(cè)定兩種常用的生物標(biāo)志物I型前膠原氨基端前肽(P1NP)和C-末端肽I型膠原的β異構(gòu)化(β-CTX)并用于測(cè)量骨轉(zhuǎn)換率。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 19.0軟件用于所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用t檢驗(yàn)，協(xié)方差分析，Pearson相關(guān)分析和偏相關(guān)來(lái)分析血漿GSN水平與其他代謝指標(biāo)的關(guān)系。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

最終納入226位受試者，其中男性114例，女性112例；受試者的基本特征和代謝指標(biāo)表示在表1中。正如預(yù)期的那樣，OP患者和NBMD受試者之間的全髖BMD在三組(A、B和C組)中顯著不同。骨轉(zhuǎn)換的標(biāo)志物(P1NP、β-CTX和β-CTX/P1NP)在某些情況下表現(xiàn)出顯著差異。在其他三個(gè)代謝指標(biāo)(血糖、總膽固醇、三酰甘油)中，只有血糖在某些情況下顯示出差異，例如在B組中?？偰懝檀己腿８视驮谌齻€(gè)亞組中的任何一個(gè)中都沒(méi)有顯著差異。我們測(cè)試了NBMD受試者與OP受試者之間血漿GSN水平的差異。ELISA測(cè)定法測(cè)得樣品中血漿GSN蛋白水平范圍為89.65至463.73 ng/mL?？紤]到年齡、BMI和P1NP對(duì)BMD的影響，我們采用協(xié)方差分析來(lái)調(diào)整混雜效應(yīng)。在A(yíng)組中男性和女性之間沒(méi)有觀(guān)察到血漿GSN水平的差異(P=0.977)。

我們發(fā)現(xiàn)血漿GSN水平在男性中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.665)，但在女性中發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009) (圖1)。與A組中的發(fā)現(xiàn)一致，B組中的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)。在C組的中，與NBMD受試者相比，OP受試者的血漿GSN水平升高1.16倍(230.08±96.84對(duì)比199.16±60.93ng/mL)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037)。對(duì)A或B組中的所有女性，統(tǒng)計(jì)分析顯示差異更為顯著，在OP受試者和NBMD受試者中血漿GSN水平的差異更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)(圖1)。

圖1 OP和NBMD受試者之間血漿GSN水平的差異注：由于年齡，BMI和P1NP對(duì)BMD的顯著影響，我們采用協(xié)方差分析來(lái)調(diào)整三組的混雜效應(yīng)，以比較OP和NBMD之間是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。A：A組的總體；B：A組的男性；C： A組的女性；D：B組；E：C組；F： B組和C組的女性，*P<0.05。Fig.1 Difference in plasma GSN levels between patients with OP and NBMD

Pearson相關(guān)分析顯示B組和C組的血漿GSN與BMD之間的呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性(r=-0.19，P=0.018)。由于BMD與PINP(r=-0.35，P=0.002)、年齡(r=-0.38，P<0.001)和BMI(r=0.70，P<0.001)顯著相關(guān)，我們采用部分相關(guān)來(lái)消除P1NP、年齡和BMI對(duì)BMD的影響。GSN與BMD呈顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.26，P=0.033) (圖2)。GSN與骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物和代謝指標(biāo)的相關(guān)性分析顯示，在A(yíng)組的女性患者中僅血糖與血漿GSN呈正相關(guān)，而血漿P1NP或β-CTX與血漿GSN無(wú)相關(guān)性。

表1 三組的基本特征Table 1 Basic characteristics of the three groups

注：與NBMD比較，*P<0.05。

圖2 血漿GSN濃度與全髖BMD的相關(guān)性注：調(diào)整了協(xié)變量BMI、年齡、P1NP對(duì)BMD的影響后，進(jìn)行部分相關(guān)分析以分析來(lái)自B組和C組的合并受試者中血漿GSN與全髖BMD的關(guān)聯(lián)。Fig.2 Correlation between plasma GSN concentration and total hip BMD

3 討論

本研究探索了血漿GSN和中老年人群的BMD相關(guān)性。結(jié)果顯示，在NBMD與OP受試者中，血漿GSN水平顯著升高，并且與絕經(jīng)后婦女的髖部BMD呈負(fù)相關(guān)?？偟膩?lái)說(shuō)，本研究的結(jié)果表明血漿GSN與老年女性的髖部骨密度有關(guān)，據(jù)我們所知這也是國(guó)內(nèi)首次關(guān)于這方面的研究。

凝溶膠蛋白(GSN)是凝溶膠蛋白超家族的基礎(chǔ)蛋白[8]，在哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物的組織和器官中具有多種功能[9]。它可以切斷肌動(dòng)蛋白絲，限制末端的快速生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)人體肌動(dòng)蛋白絲在鈣離子和pH環(huán)境下的生長(zhǎng)中起重要作用，這可以刺激GSN與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合[10]。最近的研究表明，GSN水平與許多疾病有關(guān)，如乳腺癌、口腔癌、多發(fā)性硬化和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[5,11]。GSN在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織中切斷和封閉肌動(dòng)蛋白絲起著重要作用[8]。它對(duì)于樹(shù)突狀結(jié)構(gòu)組裝，快速細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要[12]。樹(shù)突狀結(jié)構(gòu)是細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，其中肌動(dòng)蛋白發(fā)生快速聚合/解聚[13]，這對(duì)于破骨細(xì)胞、活化的內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞中的細(xì)胞黏附、機(jī)械感知和基質(zhì)重塑非常重要[14-15]。

破骨細(xì)胞可以降解骨基質(zhì)，包括細(xì)胞外基質(zhì)和一些礦物質(zhì)成分，這對(duì)骨重建和維持鈣平衡至關(guān)重要[16]。骨吸收過(guò)程的破骨細(xì)胞的活化依賴(lài)于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的完整性以及小體的黏附和運(yùn)動(dòng)功能[17]。以前的研究表明，GSN缺乏會(huì)導(dǎo)致無(wú)法產(chǎn)生Podosomes，即肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)異常、破骨細(xì)胞運(yùn)動(dòng)率降低、阻斷Podosome相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并最終導(dǎo)致骨吸收減少，并增加骨量和強(qiáng)度[12]。血漿GSN水平在兩種性別之間沒(méi)有顯著差異。然而，特別是在女性的高BMD受試者和低BMD受試者之間觀(guān)察到血漿GSN水平的顯著差異。

研究結(jié)果表明，GSN的功能可能受到性別特異性因素的影響，例如性激素。先前的研究表明，GSN可作為調(diào)節(jié)雄激素介導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成和骨吸收作用的調(diào)節(jié)因子[16]。GSN是否與雌激素相互作用以影響骨代謝和BMD尚不清楚，未來(lái)還有待研究。GSN具有兩種蛋白質(zhì)同種型，即細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外同種型，其中血漿GSN與細(xì)胞質(zhì)GSN不同[18]。 GSN可以表達(dá)并可能從CMC中分泌出來(lái)。正如兩項(xiàng)獨(dú)立的臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究所證明的那樣，CMC中GSN的表達(dá)在不同種族女性的低BMD受試者和高BMD受試者中顯著不同。在此，發(fā)現(xiàn)血漿中的GSN較弱但與髖部BMD顯著相關(guān)。上述發(fā)現(xiàn)強(qiáng)化了GSN對(duì)骨代謝的重要性，但需要進(jìn)行深入研究以確定血漿GSN對(duì)骨吸收和骨形成的影響。

總之，通過(guò)本研究的結(jié)果表明 OP患者血漿GSN水平顯著高于絕經(jīng)后非骨質(zhì)疏松女性。GSN可能是參與OP分子發(fā)病機(jī)制的潛在生物標(biāo)志物。