王赟，畢春潮，樊苗苗，趙曉霞

論著

TNF-α和IL-6在高原地區(qū)翼狀胬肉組織中的表達(dá)研究

王赟，畢春潮，樊苗苗，趙曉霞

探討高原地區(qū)與平原地區(qū)翼狀胬肉組織中TNF-α 和 IL-6 的表達(dá)情況。

免疫組織化學(xué)法和 Western blot 法檢測 29 例平原地區(qū)和 29 例高原地區(qū)翼狀胬肉患者切除的翼狀胬肉組織中的 TNF-α及 IL-6 的表達(dá)。

免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，TNF-α 位于結(jié)膜上皮細(xì)胞基底膜和胞漿，IL-6 位于結(jié)膜上皮細(xì)胞、增生的纖維組織內(nèi)及血管旁炎癥細(xì)胞胞漿中。TNF-α 在高原組的陽性表達(dá)率（86.21%）顯著高于在平原組中的陽性表達(dá)率（58.62%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）；IL-6 在高原組的陽性表達(dá)率（82.76%）顯著高于在平原組中的陽性表達(dá)率（55.12%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）。Western blot 檢測顯示 TNF-α 及 IL-6 在高原及平原翼狀胬肉組織均有表達(dá)，在高原翼狀胬肉組織中表達(dá)增強(qiáng)。

TNF-α 和 IL-6在高原地區(qū)翼狀胬肉組織中的表達(dá)增強(qiáng)，可能與高原特殊環(huán)境有關(guān)。

翼狀胬肉； 腫瘤壞死因子α； 白細(xì)胞介素6； 高原地區(qū)

翼狀胬肉是一種常見的眼科疾病，不僅影響外觀，隨著疾病的進(jìn)展，還可遮擋視物，并可通過對角膜的牽拉壓迫作用、局部淚膜的透鏡作用、角膜組織的瘢痕作用等引起角膜散光[1]。其發(fā)病機(jī)制及病因目前仍未完全清楚，但流行病學(xué)研究認(rèn)為，翼狀胬肉的形成與環(huán)境因素相關(guān)，眼部長期遭到陽光照射與風(fēng)沙、花粉、粉塵等長期、慢性刺激是主要誘因，各種因素導(dǎo)致的慢性炎癥刺激被認(rèn)為是胬肉生長的必要條件[2]。從組織病理學(xué)分析，多種細(xì)胞因子聯(lián)合作用引起上皮間充質(zhì)細(xì)胞移行，并刺激成纖維細(xì)胞新生血管化而導(dǎo)致翼狀胬肉的發(fā)生[3]。細(xì)胞因子是多種細(xì)胞所分泌的能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化、調(diào)節(jié)免疫功能、參與炎癥發(fā)生和創(chuàng)傷愈合等小分子多肽的統(tǒng)稱[4-5]。近年來大量研究表明細(xì)胞因子在翼狀胬肉發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用，它們在正常細(xì)胞中也有不同程度的表達(dá)，但在翼狀胬肉組織中表達(dá)出現(xiàn)異常[6-7]。

青海省平均海拔 3000 m 以上，日照時(shí)間長，紫外線輻射強(qiáng)，為了研究 TNF-α 和 IL-6在高原地區(qū)翼狀胬肉組織中的表達(dá)情況，本研究選取 29 例平原地區(qū)和 29 例高原地區(qū)翼狀胬肉患者切除的翼狀胬肉組織，采用免疫組織化學(xué)法和 Western blot，檢測 TNF-α 及 IL-6 表達(dá)情況，探討 TNF-α 及 IL-6 在高原地區(qū)翼狀胬肉中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 高原組：采集 2017 年 6 月~ 2018 年 10 月期間西寧市第一人民醫(yī)院就診的翼狀胬肉患者行胬肉切除術(shù) 29 例，其中男 12 例，女 17 例，年齡 30 ~ 55 歲，平均年齡（44 ± 3.45）歲。平原組：采集 2017 年 6月~ 2018 年 11 月期間西安市第四醫(yī)院就診的翼狀胬肉患者行胬肉切除術(shù) 29 例，其中男 16 例，女 13 例，年齡30 ~ 55 歲，平均年齡（50 ± 5.24）歲。術(shù)中沿翼狀胬肉頭部外約 1 mm 透明角膜處開始淺層剖切，盡量不破壞翼狀胬肉頭、頸、體部表面的上皮組織。切除后迅速用 10% 甲醛固定，另外部分液氮速凍待用。

1.1.2 試劑與儀器 兔抗人 TNF-α、IL-6 多克隆抗體購自英國 Abcam 公司；sp-9002免疫組化試劑盒（包括封閉用山羊血清、生物素、標(biāo)記二抗和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素）購自北京中杉生物技術(shù)有限公司；BCA 試劑盒、ECL 發(fā)光液、PVDF 膜、SDS 凝膠配制試劑盒、RIPA 裂解液均購自福州邁新生物技術(shù)公司；石蠟切片機(jī)購自德國 Leica 公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色法 手術(shù)取出翼狀胬肉組織甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋及連續(xù)切片，厚度 4 μm，切片 65 ℃固定 6 h，取出自然冷卻后依次用二甲苯和乙醇脫蠟和水化，PBS 沖洗干凈后，3% 過氧化氫溶液孵育 20 min，蒸餾水清洗 5 min，PBS 潤洗 5 min，浸于檸檬酸鈉緩沖液置入高壓水浴鍋內(nèi)熱修復(fù)，PBS 洗 3 次，每次 5 min。滴加一抗，37 ℃孵育 30 min 后，切片 4 ℃過夜。復(fù)溫、洗片后滴加二抗及辣根素標(biāo)記辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素孵育后滴加顯色液，沖洗、蘇木素復(fù)染、脫水，最后用中性樹膠蓋片。

1.2.2 Western blot 檢測 TNF-α 和 IL-6 表達(dá) 從液氮中取出各組織，用 RIPA 裂解液在冰上裂解組織，然后收集于離心管中繼續(xù)裂解 30 min，13 000 ×離心 10 min，收集上清，測定蛋白濃度，加入 4 × 上樣緩沖液，煮沸 5 min，充分變性，–20 ℃保存?zhèn)溆?。制膠：10% 分離膠 + 5% 濃縮膠，按蛋白濃度確定上樣量，然后經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。一抗孵育過夜，PBS 洗滌，二抗室溫孵育 1.5 h，PBS 洗滌，ECL 發(fā)光液顯色、顯影、拍照，用 Image pro plus 軟件對灰度值進(jìn)行分析。

1.2.3 結(jié)果判讀及統(tǒng)計(jì)分析 免疫組化結(jié)果以染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行綜合分析，TNF-α 位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，IL-6 位于細(xì)胞質(zhì)中。TNF-α 及 IL-6 陽性表達(dá)呈黃色、棕黃色、褐色顆粒。按染色強(qiáng)度記分：未著色記 0 分，淡黃記 1 分，棕黃記 2分，棕褐記 3分。按著色細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞總數(shù)記分：陽性細(xì)胞數(shù)≤ 5% 記 0 分，6% ~ 25% 記 1 分，26% ~ 50% 記 2 分，≥ 51% 記 3 分。根據(jù)兩項(xiàng)積分之和判定其結(jié)果，< 3 分為陰性（–），≥ 3 分為陽性（+），≥ 4 分為弱陽性（++），≥ 6 分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用 Image-Pro Plus 6.0 軟件檢測吸光度值。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析在 SPSS21.0 中處理，< 0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α 和 IL-6 在高原地區(qū)翼狀胬肉組織中表達(dá)增強(qiáng)

HE 染色顯示，高原地區(qū)患者翼狀胬肉病變內(nèi)膠原纖維排列密集，成纖維細(xì)胞增殖活躍，新生血管豐富，大量的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞的浸潤以及肥大細(xì)胞反應(yīng)。平原地區(qū)患者翼狀胬肉病變內(nèi)多無定形物質(zhì)的聚集。免疫化學(xué)染色法結(jié)果顯示 TNF-α 表達(dá)部位見于結(jié)膜上皮細(xì)胞基底膜和胞漿，IL-6 表達(dá)部位見于結(jié)膜上皮細(xì)胞、增生的纖維組織內(nèi)及血管旁炎癥細(xì)胞胞漿中（圖 1）。平均光密度值測定顯示，IL-6 蛋白在高原組的表達(dá)（0.583 ± 0.022），顯著高于平原組中的表達(dá)（0.350 ± 0.035），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05），TNF-α 蛋白在高原組中的表達(dá)（0.553 ± 0.018），顯著高于平原組中的表達(dá)（0.273 ± 0.016），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）。

免疫化學(xué)染色法統(tǒng)計(jì)分析顯示，TNF-α 在平原組的陽性表達(dá)率為 58.62%，高原組陽性率為 86.21%，高原組陽性表達(dá)率顯著高于平原組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）。IL-6 在平原組陽性表達(dá)率為 55.12%，在高原組中的陽性表達(dá)率82.76%，高原組陽性率顯著高于平原組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）（表 1）。

圖 1 DBA 染色顯示TNF-α 和 IL-6 在翼狀胬肉組織中的表達(dá)（× 400，*P < 0.05）

Figure 1 Expression of TNF-α and IL-6 in pterygium tissues by DBA staining (× 400,*< 0.05)

表 1 翼狀胬肉組織中TNF-α 和 IL-6 表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果

圖 2 Western blot 檢測TNF-α 和 IL-6 在翼狀胬肉組織中的表達(dá)（*P < 0.05）

Figure 2 Expression of TNF-α and IL-6 in pterygium tissues by Western blot

2.2 Western blot 檢測 TNF-α 和 IL-6 表達(dá)

灰度值分析顯示，TNF-α 和 IL-6 在平原組和高原組翼狀胬肉組織均有明顯的表達(dá)，且在高原組中的表達(dá)顯著高于平原組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）（圖 2）。

3 討論

翼狀胬肉是眼科常見的慢性炎癥性病變，是一種增生性、變性疾病。最近的研究表明，翼狀胬肉主要表現(xiàn)為纖維血管組織的大量增生，且侵襲力較強(qiáng)，破壞了角膜緣的結(jié)構(gòu)，并侵入角膜內(nèi)呈進(jìn)行性生長[7]。該病在國內(nèi)不同地區(qū)報(bào)道的發(fā)病率差異較大，高原地區(qū)發(fā)病率更高。高原地區(qū)紫外線明顯強(qiáng)于平原地區(qū)，大量研究表明，紫外線的輻射在翼狀胬肉發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[8-9]。紫外線輻射可通過氧化應(yīng)激損傷和直接的光毒性兩種機(jī)制誘導(dǎo)各種炎癥因子的表達(dá)，如 TNF-α 和 IL-6[2]。高原地區(qū)除了紫外線輻射強(qiáng)外，低氧也是引起翼狀胬肉發(fā)生非常重要的因子，據(jù)報(bào)道，高原小鼠模型在低氧環(huán)境下，TNF-α、IL-6 升高顯著[10]?？梢娮贤饩€和低氧等因子均影響著細(xì)胞 TNF-α 和 IL-6 的表達(dá)。IL-6 作為重要的炎癥因子，具有促進(jìn)纖維母細(xì)胞的增殖和新生血管形成的功能，而纖維母細(xì)胞的增生又能促進(jìn) IL-6 的分泌表達(dá)，形成惡性循環(huán)，促進(jìn)翼狀胬肉的發(fā)展，也是造成翼狀胬肉復(fù)發(fā)的主要原因[11]。TNF-α 可以促進(jìn)纖維細(xì)胞的大量增殖，促進(jìn)纖維細(xì)胞形成膠原，參與血管的發(fā)生，也可刺激單核巨噬細(xì)胞合成 IL-1、IL-6、IL-8，從而加重炎癥，在翼狀胬肉的形成過程中發(fā)揮著不可忽視的作用[12]。

本研究選取了生活在海拔 3000 米以上高原地區(qū)患者翼狀胬肉組織及生活在海拔 500 米地區(qū)患者翼狀胬肉組織。在病理表現(xiàn)上，HE 染色顯示高原地區(qū)患者翼狀胬肉組織上皮層增厚，上皮細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞體積有增大趨勢，上皮基底部呈不規(guī)則樣改變，組織間質(zhì)中新生血管數(shù)量增加，而平原地區(qū)患者翼狀胬肉組織中該病理表現(xiàn)較高原地區(qū)不明顯；其次，在炎癥因子表達(dá)方面，高原地區(qū)翼狀胬肉組織中 TNF-α 和 IL-6 mRNA、蛋白水平均顯著高于平原地區(qū)翼狀胬肉組織。這也說明，高原地區(qū)各種因子（日照、紫外線、低氧等）具有促進(jìn) TNF-α 和 IL-6 增強(qiáng)表達(dá)的作用，在翼狀胬肉的形成中起著很重要的作用，這與前人對紫外線、低氧對 TNF-α 和 IL-6 的表達(dá)研究結(jié)果一致[2, 10, 13]。研究表明，長期受到太陽光照射環(huán)境的人群發(fā)病率較高，可能與環(huán)境中較多的致炎因子有很大關(guān)系[14]。這也可能是造成高原地區(qū)翼狀胬肉組織 TNF-α 和IL-6 表達(dá)增高的原因。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了 TNF-α 和 IL-6 作為重要的炎癥因子在翼狀胬肉發(fā)病中起著非常重要的作用。

綜上所述，翼狀胬肉的形成是一種多因素、多階段的發(fā)展過程，其病理機(jī)制還未完全闡明，高原地區(qū)紫外線、低氧等因素具有促進(jìn) TNF-α 和 IL-6 表達(dá)增強(qiáng)的作用，在翼狀胬肉的形成中起著很重要的作用，此研究為翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制研究和臨床檢測及預(yù)防提供一定的理論基礎(chǔ)。

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Expression of TNF-α and IL-6 in pterygium tissues of plateau area

WANG Yun, BI Chun-chao, FAN Miao-miao, ZHAO Xiao-xia

To investigate the expression of TNF-α and IL-6 in pterygium of plateau area and plain area.

Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the expression of TNF-α and IL-6 in the excised pterygium tissues of 29 patients with pterygium in plain area and 29 patients with pterygium in plateau area.

Immunohistochemical results showed that TNF-α was located in the basement membrane and cytoplasm of conjunctival epithelial cells, while IL-6 was located in the cytoplasm of conjunctival epithelial cells, proliferated fibrous tissues and perivascular inflammatory cells. The positive expression rate of TNF-α in plateau group (86.21%) was significantly higher than that in plain group (58.62%). The difference was statistically significant (< 0.05). The positive expression rate of IL-6 in plateau group (82.76%) was significantly higher than that in plain group (55.12%). The difference was statistically significant (< 0.05). The results from Western blot analysis showed that TNF-α and IL-6 were expressed in plateau and plain pterygium tissues, but increased in plateau pterygium tissues.

The expression of TNF-α and IL-6 is increased in pterygium tissues of plateau area, which may be related to the special environment of the plateau.

Pterygium; Tumor necrosis factor-alpha; Interleukin-6; Plateau area

WANG Yun, Email: wangyun2888@163.com

Author Affiliations: Ophthalmology, Xining First People's Hospital, Qinhai 810012, China (WANG Yun, FAN Miao-miao, ZHAO Xiao-xia); Ophthalmology, The Fourth Hospital of Xi'an, Shaanxi 710004, China (BI Chun-chao)

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.06.008

西寧市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017-k-08）

810012 青海，西寧市第一人民醫(yī)院眼科（王赟、樊苗苗、趙曉霞）；710004 陜西，西安第四醫(yī)院眼科（畢春潮）

王赟，Email：wangyun2888@163.com

2019-05-07