李娜，丁玲，馬萌，孫千一，王紅燕，李拓

論著

MAPREC與MNVT評價III型Sabin株脊髓灰質(zhì)炎病毒神經(jīng)毒力的比較

李娜，丁玲，馬萌，孫千一，王紅燕，李拓

用 PCR 擴(kuò)增及限制性酶切分析突變技術(shù)（MAPREC）和猴體神經(jīng)毒力試驗(yàn)（MNVT）評價同一批 III 型 Sabin 株脊灰病毒神經(jīng)毒力的結(jié)果差異。

采用 MAPREC 技術(shù)，檢測 III 型 Sabin 株脊灰病毒神經(jīng)毒力關(guān)鍵位點(diǎn) 472 位點(diǎn)突變率；采用 MNVT 病理切片分析，評價 III 型 Sabin 株脊灰病毒神經(jīng)毒力。

在III 型 Sabin 株脊灰病毒神經(jīng)毒力檢測方面，操作簡單，試驗(yàn)周期短的MAPREC 技術(shù)可作為金標(biāo)準(zhǔn) MNVT 的有益補(bǔ)充。

神經(jīng)毒力； III 型 Sabin 株脊髓灰質(zhì)炎病毒； 分子水平； 動物水平

Sabin 株脊髓灰質(zhì)炎病毒（脊灰病毒）由于其安全性高、免疫效果好的優(yōu)勢，被世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦在發(fā)展中國家用于生產(chǎn)脊灰病毒疫苗。目前市面上使用 Sabin 株生產(chǎn)的脊灰病毒疫苗包括口服 Sabin 脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗（oral poliovirus vaccine，OPV）和 Sabin 脊灰病毒滅活疫苗（sabin inactivated poliovirus vaccine，sIPV）。自 Sabin 株脊灰疫苗使用以來，脊髓灰質(zhì)炎病例自 1988 年以來已減少了 99% 以上，從 35 萬多例的估計(jì)數(shù)減少到 2017 年的 22 例報(bào)告病例，為全球消除脊灰病毒做出了巨大貢獻(xiàn)。如今，世界上只有巴基斯坦、阿富汗和尼日利亞三個國家沒有消滅脊髓灰質(zhì)炎的傳播，偶有病例報(bào)告。Sabin 株脊髓灰質(zhì)炎病毒是由野毒株 Salk 株經(jīng)連續(xù)低溫傳代得到，Sabin 株 OPV 遺傳物質(zhì)比較穩(wěn)定，但接種 OPV 仍會出現(xiàn)極低概率的疫苗相關(guān)的麻痹性脊髓灰質(zhì)炎（vaccine associated paralytic poliomyelitis，VAPP）及疫苗衍生脊髓灰質(zhì)炎病毒（vaccine derived poliovirus，VDPV）現(xiàn)象[1]。主要原因是 Sabin 株毒株在傳代時候發(fā)生了基因突變，導(dǎo)致神經(jīng)毒力恢復(fù)。因此在疫苗生產(chǎn)中，檢測 Sabin 株脊灰病毒神經(jīng)毒力是必要的[2]。目前神經(jīng)毒力檢測方法主要包括以下幾個方法：①猴體神經(jīng)毒力試驗(yàn)（monkeys neurovirulence test，MNVT），該方法是 Sabin 株脊灰病毒神經(jīng)毒力檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，2015 版《中國藥典》要求每批 OPV 疫苗需通過 MNVT 檢測；② Tg PVR21 轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)毒力試驗(yàn)方法，該方法轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)脊灰病毒受體，使小鼠對脊灰病毒易感，從而評價神經(jīng)毒力，該方法涉及專利問題，不被允許大規(guī)模應(yīng)用[3]；③ PCR 擴(kuò)增及限制性酶切分析突變技術(shù)（mutant analysis by PCR and restriction enzyme cleavage，MAPREC），檢測重要毒力位點(diǎn)突變率，該方法基于分子生物學(xué)方法，操作簡單，要求較低；④深度測序技術(shù)，大規(guī)模平行測序，監(jiān)控所有基因位點(diǎn)改變。本研究利用 MAPREC 從分子水平和 MNVT 從動物水平共同檢測一批 III 型 Sabin 株脊灰病毒神經(jīng)毒力，對比檢測結(jié)果是否保持一致。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品 MAPREC 實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)品均購自英國國家生物制品檢定所（national institute for biological standards and control，NIBSC），具體信息如表 1 所示。猴體神經(jīng)毒力實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品為：脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗參考品，購自 NIBSC，批號 III-1981。試驗(yàn)樣品為III 型 Sabin 株脊灰病毒，批號：III201101，來自北京生物制品研究所有限責(zé)任公司。

表 1 MAPREC 標(biāo)準(zhǔn)品信息

1.1.2 主要儀器及試劑 CF16RN 離心機(jī)為日本日立公司產(chǎn)品；Azure Sapphire 多功能分子成像系統(tǒng)為美國 Azure 公司產(chǎn)品；Hoefer-SE600-Ruby 垂直電泳儀為美國通用電氣公司產(chǎn)品；T-100 基因擴(kuò)增儀為美國伯樂公司產(chǎn)品；EG1150 C 冰臺、EG1150 H 包埋機(jī)、HI 1220 烘片機(jī)、RM2245 切片機(jī)均為德國徠卡公司產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶I（1501804）、I（10007459）購自 New England Biolabs 公司；病毒 RNA 提取試劑盒（R6423）購自天根生物科技有限公司；SuperScriptTMIV First-Strand Synthesis System（00599722）、AmpliTaq Gold 360 Master Mix（1710071）均購自美國賽默飛公司；沒食子藍(lán)（MKBT6206V）、加拿大樹膠（20150324）、正丁醇（20141114）、乙醚（20180201）、無水乙醇（20170902）、丙酮（20170210）、二甲苯（20170601）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 引物探針序列 引物 pA-3/484 序列：5' CAGGCTGGCTGCTGGGTTGCAGCTGCCTGC 3'，工作濃度均為 3 μg/ml。pS-3/470 序列：5' TGAGCTACATGAGAGTGCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTGA 3'，工作濃度均為 30 μg/ml。引物與 CY5 標(biāo)記的 pA-3/484 探針（CY5-pA-3/484）均由生工生物（上海）科技有限公司合成。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)用恒河猴購自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（京）2015-0011。北京所實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SYXK（京）2016-0051。恒河猴為抗脊灰病毒抗體陰性、體重> 1.5 kg、檢疫合格的一級實(shí)驗(yàn)用猴，未作其他實(shí)驗(yàn)，2018087-2018108 號免疫參考品，2018109-2018130 號免疫樣品。

1.2 方法

1.2.1 MAPREC 檢測 III 型 Sabin 脊灰病毒 472-C 突變率

1.2.1.1 RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄制備 cDNA 按照病毒 RNA 提取試劑盒說明書，提取待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)品 LMVR、HMVR 的病毒基因組 RNA，隨后立刻按 SuperScriptTMIV First-Strand Synthesis System 說明書進(jìn)行體外反轉(zhuǎn)錄，得到 3 種 cDNA。

1.2.1.2 非對稱 PCR 最佳模板濃度篩選[4]按以下比例配置非對稱 PCR 反應(yīng) Mix：2 × PCR Master Mix 25 μl，pA-3/484 和 pS-3/470 各 5 μl，H2O 10 μl，總體積 45 μl。

每個 cDNA 組有 7 管，除 1 號管加入56.25 μl 非對稱 PCR Mix 外，2 ~ 7 號管中各加50 μl 非對稱 PCR Mix。分別取 6.25 μl cDNA 加到對應(yīng)的 1 號管中，混勻后取 12.5 μl 移到 2 號管，依次重復(fù)，直至 7 號管混勻后棄去 12.5 μl 液體。

另取 5 管為對照，每管加 45 μl 非對稱 PCR 反應(yīng) Mix，分別加入 0.01 μg/ml 100% DNA，2 支 0.01 μg/ml IS DNA，分別命名為 IS DNA-A 和 IS DNA-B，無菌水、反轉(zhuǎn)錄對照各 5 μl。

按照以下條件進(jìn)行 PCR 反應(yīng)：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，運(yùn)行 40 個循環(huán)，72 ℃ 7 min。取 10 μl 擴(kuò)增產(chǎn)物，加入 PCR Master Mix 和 6 μg/ml 的標(biāo)記探針 CY5-pA-3/484 各 1 μl，混勻離心后 72 ℃反應(yīng) 10 min，進(jìn)行 PCR 產(chǎn)物的熒光標(biāo)記。取 4 μl 標(biāo)記產(chǎn)物加入 1 μl 30% 甘油，進(jìn)行 10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳。Azure Sapphire 設(shè)備里 CY-5 模式下掃描、成像、分析。

1.2.1.3 突變率檢測 選擇目的條帶明顯，且引物剩余少的最高稀釋管的 PCR 產(chǎn)物用于酶切和

定量分析。取 6 μl 標(biāo)記混合物，加入終濃度分別為 2 U/μl 的 Mbo I 酶切工作體系 1 μl，37 ℃孵育 2 h，電泳后在 Azure Sapphire 設(shè)備里 CY-5 模式下掃描、成像、分析，共進(jìn)行 5 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.2 猴體神經(jīng)毒力實(shí)驗(yàn)[5-6]

1.2.2.1 樣品稀釋 供試品滴度調(diào)至 105.5~ 106.5半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染量（50% cell culture infective dose，CCID50）/0.1 ml。

1.2.2.2 猴體免疫 將已麻醉的猴子各 14 只分別免疫，在第一腰椎處，將針頭在正中略斜處刺入，免疫 0.1 ml 樣品及參考品，在籠上標(biāo)記猴號，觀察 17 ~ 22 d。北生研根據(jù)《北京市實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查指南》、《北京實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》制定了《實(shí)驗(yàn)動物福利倫理及動物實(shí)驗(yàn)安全審查 SOP》，實(shí)驗(yàn)中所涉及的實(shí)驗(yàn)動物均嚴(yán)格遵守該 SOP，充分考慮動物的利益，善待動物，防止或減少動物的應(yīng)激、痛苦和傷害，尊重動物生命，制止針對動物的野蠻行為、采取痛苦最少的方法處置動物。實(shí)驗(yàn)方法和目的符合道德倫理標(biāo)準(zhǔn)和國際慣例。

1.2.2.3 組織切片染色計(jì)分 觀察期末將動物處死后，石蠟包埋大腦和脊髓不同部位并切片（厚度 9 ~ 15 μm），經(jīng)沒食子藍(lán)染色后，鏡下檢查。根據(jù)病毒活性計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)對每只猴腰髓切片，以猴腦及脊髓中線為界，左右分別計(jì)分，并判斷是否是有效猴（每只猴 29 塊組織切片中任意 1 切片評分≥ 2，則視為有效猴），評分標(biāo)準(zhǔn)[5]：沒有損傷為 0 分；僅有細(xì)胞浸潤為 1 分；細(xì)胞浸潤伴有少量的神經(jīng)元損害，為 2 分；細(xì)胞浸潤伴有廣泛的神經(jīng)元損害，為 3 分；大量的神經(jīng)元損害，伴有或無細(xì)胞浸潤，為 4 分。再對其他部位切片左右分別計(jì)分，統(tǒng)計(jì)出腰、頸、腦部的各自平均分，統(tǒng)計(jì)單只猴的病變平均分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 最佳 PCR 模板濃度篩選

對于逆轉(zhuǎn)錄的 cDNA 進(jìn)行 5 倍梯度稀釋，作為非對稱 PCR 的模板，待測樣品最佳 PCR 模板濃度篩選電泳結(jié)果如圖 1 所示，54倍稀釋度為最高稀釋度且不產(chǎn)生引物二聚體的稀釋濃度，待測樣品 cDNA 模板 54倍稀釋下的 PCR 產(chǎn)物作為我們下一步定量分析的目標(biāo)。HMVR 和 LMVR 的最佳 PCR 模板濃度篩選電泳圖與圖 1 一致。HMVR 為 57倍稀釋，LMVR 為 56倍稀釋。

圖 1 PCR 模板篩選電泳圖

Figure 1 Electropherogram for PCR template screening

2.2 定量突變率檢測

利用篩選出的最佳 PCR 模板的產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記、酶切、電泳、掃描成像后對酶切條帶的灰度值進(jìn)行分析，根據(jù)各個條帶的灰度值計(jì)算各個樣品的突變率，電泳結(jié)果掃描如圖 2 所示。5 次重復(fù)酶切突變率如表 2 所示，IS DNA-A 與 IS DNA-B 的比值為 1.004，結(jié)果接近 1。IS DNA-A與 IS DNA-B 的測定值波動小，檢測值在 ± 3之間。LMVR 的檢測突變率低于同步檢測的 IS DNA 的檢測突變率。HMVR 的檢測突變率高于同步檢測的 IS DNA 的檢測突變率，樣品合格。

2.3 猴體神經(jīng)毒力實(shí)驗(yàn)切片分析

由同一人采用計(jì)分法在顯微鏡下觀察并在鏡檢結(jié)果記錄表中記錄結(jié)果，并評分，圖 3 為試驗(yàn)中神經(jīng)元病變圖。圖 3A 為針跡反應(yīng)；圖 3B 為正常神經(jīng)元，評為 0 分；圖 3C 僅有細(xì)胞浸潤，評為 1 分；圖 3D 細(xì)胞浸潤伴有少量的神經(jīng)元損害，評為 2 分；圖 3E 細(xì)胞浸潤伴有廣泛的神經(jīng)元損害，評為 3 分。

圖 2 定量檢測電泳圖（突變率 = d/(c + d) – b/(a + b)，“–”表示非酶切，“+”表示酶切）

Figure 2 Electropherogram for quantitative detection of mutation rate (Mutant rate = d/(c + d) – b/(a + b), “–” represent non-digested DNA, “+” represent digested DNA)

表 2 5 次定量檢測結(jié)果分析（%）

圖 3 猴體神經(jīng)病變切片圖（40 ×）

Figure 3 Picture for monkey nerve tissue lesion slice (40 ×)

表 3 每只猴的 Ls 值

2.4 猴體神經(jīng)毒力實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

3 討論

Sabin 株脊灰病毒疫苗由于其成本低廉和免疫效果好的原因被發(fā)展中國家大量生產(chǎn)使用。2015 版《中國藥典》OPV 成品及 sIPV 毒種需要經(jīng)過 MNVT 檢測，證明其神經(jīng)毒力在可控范圍。MNVT 實(shí)驗(yàn)作為脊灰病毒神經(jīng)毒力驗(yàn)證的金標(biāo)準(zhǔn)，是疫苗生產(chǎn)廠商目前檢測其疫苗安全性最可靠的方法。但是 MNVT 耗時周期長達(dá)一個月，在日常工作中會拖慢工作進(jìn)度。MAPREC 實(shí)驗(yàn)從分子水平檢測某個具體關(guān)鍵位點(diǎn)的突變率反映整體疫苗的安全程度，具有實(shí)驗(yàn)操作簡單，實(shí)驗(yàn)周期短等特點(diǎn)，MAPREC 實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時檢測，能客觀反映待測樣品相對于標(biāo)準(zhǔn)品的突變程度。在目前階段，疫苗生產(chǎn)單位可以輔助使用MAPREC 技術(shù)用于 Sabin 株脊灰病毒的突變率的監(jiān)測，作為風(fēng)險監(jiān)控的指標(biāo)，快速指導(dǎo)生產(chǎn)工作的安排。在本文中，我們使用 MAPREC 技術(shù)和 MNVT 同時對一批 III 型 Sabin 株脊灰病毒神經(jīng)毒力進(jìn)行檢測。試驗(yàn)表明，兩種不同的技術(shù)，得到的結(jié)果是一致的。但目前對于 Sabin 減毒株關(guān)鍵毒力位點(diǎn)的研究還不是十分明確，因此目前 MAPREC 實(shí)驗(yàn)仍不能取代 MNVT。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，對 Sabin 株脊灰病毒回復(fù)突變的研究的深入，Sabin 株脊灰病毒回復(fù)突變原理逐漸清晰，控制神經(jīng)毒力的關(guān)鍵位點(diǎn)被明確找到后，一個替代MNVT 的分子生物學(xué)技術(shù)有望得到應(yīng)用。

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Evaluation of the neurovirulence of type III Sabin strain poliovirus through MAPREC and MNVT

LI Na, DING Ling, MA Meng, SUN Qian-yi, WANG Hong-yan, LI Tuo

To study the difference between the neurovirulence of the same type III Sabin strain poliovirus examined by MAPREC and MNVT.

The MARPEC assay was used to detect the point mutation rate of the 472 site, which are the key sites of the virulence of the type III Sabin strain poliovirus. The paraffin sections of the MNVT was analyzed to evaluate the neurovirulence of the type III Sabin strain poliovirus.

In the detection of virulence of poliovirus type III Sabin strain, the simple operation and short test period of MAPREC can be used as a beneficial supplement to the gold standard MNVT.

Neurovirulence; Type III Sabin strain poliovirus; Molecular level; Animal level

LI Tuo, Email: little0815@qq.com

Author Affiliation: Department of Quality Control (LI Na, DING Ling, MA Meng, SUN Qian-yi, LI Tuo), Department of Vaccine Facility 4 (WANG Hong-yan), Beijing Bio-Institute Biological Products Co., Ltd., Beijing 100176, China

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.06.003

“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(xiàng)（2018ZX09737008）

100176 北京生物制品研究所有限責(zé)任公司質(zhì)量檢定室（李娜、丁玲、馬萌、孫千一、李拓），疫苗 4 室（王紅燕）

李拓，Email：little0815@qq.com

2019-08-02