趙慧強，劉超，胡澤斌，戴詩云，王華

論著

Decorin提升小鼠脾臟細胞對乳腺癌細胞系4T1的免疫響應性

趙慧強，劉超，胡澤斌，戴詩云，王華

評價高表達核心蛋白聚糖（Decorin）的小鼠乳腺癌細胞系 4T1 對正常小鼠脾細胞的免疫激活效應，明確 Decorin 對抗腫瘤免疫的調(diào)節(jié)作用。

采用攜帶Decorin 基因的復制缺陷型重組腺病毒 Ad.DCN 感染小鼠乳腺癌細胞系 4T1。與小鼠脾細胞共培養(yǎng) 3 d 后，通過流式細胞術(shù)檢測小鼠脾細胞的 CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、T 記憶細胞（Tm）和T 調(diào)節(jié)細胞（Treg）的百分比；利用實時定量 PCR（qPCR）技術(shù)檢測 Th1 類細胞因子IL-2、IL-12、TNF-α和IFN-γ 的表達，Th2 類細胞因子IL-4、IL-6、IL-10 和轉(zhuǎn)化生長因子 β（TGF-β）的表達，以及與殺傷相關(guān)基因穿孔素與顆粒酶 B 的表達。

與小鼠乳腺癌細胞系 4T1 共培養(yǎng)后，小鼠脾細胞 CD4+T 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞、Treg 細胞比例無明顯改變，但Tm 細胞比例顯著升高；同時，細胞因子、穿孔素和顆粒酶 B 表達下調(diào)。但是，病毒感染的 4T1 細胞，特別是 Ad.DCN 感染的 4T1 細胞可顯著抑制 Treg 細胞，并部分逆轉(zhuǎn)細胞因子表達的下調(diào)。

Decorin 高表達可增強正常小鼠脾臟細胞對乳腺癌細胞系 4T1 的免疫響應性，從而激活抗腫瘤免疫反應。

核心蛋白聚糖； 乳腺腫瘤； 基因，MHC II 類； 脾細胞； 4T1 細胞系

乳腺癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率居于女性惡性腫瘤第一位，約占女性惡性腫瘤的 25%；同時，乳腺癌的死亡率約占腫瘤總死亡率的 15%[1]，高居女性癌癥死亡率的第 5 位。當前腫瘤生物治療發(fā)展迅速，其通過激活機體內(nèi)在免疫功能達到增強機體對腫瘤細胞的免疫應答，并使宿主對腫瘤細胞產(chǎn)生長期抑制效應?；蛑委熥鳛槟[瘤生物治療的前沿技術(shù)，主要利用多種病毒或非病毒載體，將目的基因?qū)氚屑毎瑢崿F(xiàn)目的基因的靶向和高效表達，從而治療疾病。

核心蛋白聚糖（Decorin，DCN）是重要的腫瘤抑制分子，本課題組及其他研究團隊的研究結(jié)果證實，Decorin 對多種腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移有很好的治療作用[2-10]，其主要機制包括抑制wnt/β-catenin、Met、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等多條腫瘤生長和轉(zhuǎn)移信號通路等。但是，其對乳腺癌及其轉(zhuǎn)移的治療作用及機制，特別是抗腫瘤免疫激活機制尚未完全闡明。Decorin是TGF-β 的天然抑制分子，而 TGF-β 在誘導腫瘤免疫耐受過程中發(fā)揮重要作用，在腫瘤轉(zhuǎn)移患者的外周血和腫瘤微環(huán)境中均可檢測到大量 TGF-β 的表達。那么，作為TGF-β 的天然抑制分子，Decorin 是否具有激活機體免疫的作用呢？本研究通過體外實驗，對 Decorin 調(diào)節(jié)乳腺癌細胞系 4T1 激活小鼠脾臟細胞免疫的作用進行進一步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系、病毒及試劑 4T1 細胞系由軍事科學院軍事醫(yī)學研究院提供；重組腺病毒Ad.DCN、Ad.Null 由本室保存；1640 培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司；胎牛血清購自美國 Gemini 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 Genestar 公司；抗小鼠 CD3、CD4、CD8、CD44、CD62L 抗體購自美國 BD 公司；Treg 試劑盒購自美國 eBioscience 公司。

1.1.2 實驗動物 BALb/c 小鼠，雌性，4 ~ 6 周齡，購于維通利華公司，飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學研究院動物房。

1.2 方法

1.2.1 4T1 細胞系培養(yǎng)擴增 使用含 10% 胎牛血清的 1640 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的4T1 細胞系，棄培養(yǎng)液，使用 PBS 洗滌后，加入0.05% 胰酶，恒溫箱孵育完全消化后加入培養(yǎng)液中和胰酶，細胞懸液離心后棄上清，用培養(yǎng)液重懸，按照 1:3 比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 BALb/c 小鼠脾細胞制備 頸椎脫臼處死小鼠，75% 酒精浸泡，于小鼠左下腹下肢與肋下緣之間取脾，持鑷輕夾脾臟，注意保證脾臟的完整性，切下的脾臟放入含 PBS 液的平皿中暫存。將獲得的脾臟放置在不銹鋼網(wǎng)上輕輕研磨，獲取細胞懸液，收集細胞懸液離心，用紅細胞裂解液裂紅，PBS 洗滌 2 次，重懸，計數(shù)，備用。

1.2.3 實驗分組 實驗分為兩組，一組測定 CD3、CD4 和 CD8，共 3 塊板，每塊板為一個樣本；另一組測定T 記憶細胞（memory T cell，Tm）、T 調(diào)節(jié)細胞（Treg）及目的基因，共 9 塊板，每 3 塊板為一個樣本，共計12 塊六孔板，每塊板均設空白對照孔。

將 4T1 細胞計數(shù)，按照每孔 5 × 105的濃度將培養(yǎng)擴增后的細胞鋪于六孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng) 24 h 后，使用 Ad.DCN 和 Ad.Null 病毒感染 4T1 細胞，感染 4 h 后使用環(huán)孢霉素作用 2 h，然后更換培養(yǎng)基；感染病毒 24 h 后，每孔加入 5 × 106脾細胞。一組培養(yǎng) 3 d 收集脾細胞，標記 PE-CD3、PerCP-Cy5.5-CD4 和 FITC-CD8a。二組培養(yǎng) 3 d，收集細胞，分別進行如下檢測：①提取 RNA，反轉(zhuǎn)錄，實時定量 PCR（qPCR）檢測 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶 B 表達；②檢測 Treg 細胞比例；③檢測 Tm 細胞比例。

1.2.4 Tm 細胞比例測定 將收取的細胞離心后棄上清，用 PBS 洗滌 1 次，然后標記抗體。取 PE-CD44、Alexa Fluor488-CD4、APC-CD62L、PerCP-Cy5.5-CD3 抗體各 2 μl 至 100 μl PBS 中混勻，加入到細胞懸液中，4 ℃避光孵育 30 min；孵育結(jié)束后離心，再次使用 PBS 洗滌 1 次；500 μl PBS 重懸細胞，上機檢測。

1.2.5 Treg 細胞比例測定 將收取的細胞離心，用 PBS 洗滌一次，然后標記抗體。取FITC-CD4 和 APC-CD25 抗體各 0.6 μl加入 50 μl PBS 中混勻，加入到細胞懸液中，4 ℃避光孵育 30 min；孵育結(jié)束后加入 PBS 洗滌，離心后加入 stainingbuffer 洗滌，再次離心，加入固定/透化液（按要求1:3 稀釋），4 ℃孵育 30 min，孵育完成后離心，加入透化 buffer（用去離子水稀釋成 1 ×），離心后再次加入透化buffer，離心。然后每樣本加入50 μl PBS（含 1 μl FC 阻斷劑），避光 4 ℃孵育15 min，孵育完成后加入 50 μl PBS（含 1 μl PE-Cy7-FoxP3 的抗體）避光 4 ℃孵育 30 min；孵育完成后加入透化buffer，洗滌細胞，離心；最后 300 μl PBS 重懸細胞，上機檢測 CD4+CD25+FoxP3+細胞比例。

1.2.6 CD3+、CD4+和 CD8+T 細胞檢測 收集淋巴細胞離心，PBS 重懸后再次離心，每管用 50 μl PBS 重懸，并分別加入 1.5、1 和 0.5 μl的 PE-CD3、PerCP-Cy5.5-CD4 和FITC-CD8a，避光孵育半小時；孵育完成后加入 PBS 洗滌 2 次，每樣本加入 400 μl的 PBS 重懸，上機檢測。

1.2.7 qPCR 檢測 配制樣本，采用 20 μl體系，每樣本 4 復孔。利用實時定量 PCR 儀進行目的基因檢測。方法選用相對定量法，熒光試劑選擇SYBR 綠色熒光染料，運行模式采用2 h 標準程序，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40 個循環(huán)。

1.2.8 免疫印跡 收集 4T1.Null 和 4T1.DCN 細胞的蛋白，標記鼠抗人 Decorin 抗體，通過免疫印跡檢測 Decorin 蛋白的表達。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒 Ad.DCN 高效介導 Decorin 蛋白在 4T1 的表達

重組腺病毒 Ad.DCN 以 5000 VPs/細胞感染 4T1 后 48 h，收集細胞，提取蛋白，通過免疫印跡檢測 Decorin 蛋白的表達，從圖 1 可以看到，重組腺病毒可高效介導 Decorin 蛋白在 4T1 細胞中的表達。

圖 1 免疫印跡法檢測 Decorin 蛋白表達

Figure 1 The protein expression of Decorin detected by Western blot

2.2 Decorin 高表達的 4T1 細胞對小鼠脾臟 CD4+/CD8+T 淋巴細胞無顯著影響

將 4T1、4T1.Null 和 4T1.DCN 細胞與正常小鼠脾臟淋巴細胞共培養(yǎng) 3 d 后，流式細胞術(shù)檢測小鼠脾臟 T 細胞中 CD4+和 CD8+細胞的比例，結(jié)果顯示（圖 2），4T1 細胞中，Decorin 高表達對小鼠脾臟 CD4+/CD8+T 淋巴細胞的比例無顯著影響。

2.3 Decorin 高表達可下調(diào) Treg 細胞比例

Tm 細胞是免疫記憶細胞，在二次免疫應答中起重要作用。流式細胞分析顯示，4T1、4T1.Null 和 4T1.DCN 均可以誘導脾臟Tm 細胞比例升高，4T1.Null 和 4T1.DCN與 4T1 之間無統(tǒng)計學差異（圖3A）。表明 4T1 可以誘導小鼠脾細胞產(chǎn)生較強的免疫記憶，Decorin 不會進一步增強這種誘導作用。

Treg 細胞是免疫調(diào)節(jié)細胞，可以保持機體的免疫穩(wěn)態(tài)。流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示，4T1.Null 和4T1.DCN 組 Treg 細胞比例明顯下調(diào)，與對照組之間具有統(tǒng)計學差異（圖3B）。

2.4 Decorin 高表達的 4T1 細胞系可部分逆轉(zhuǎn)細胞因子表達下調(diào)

細胞共培養(yǎng) 3 d，收集培養(yǎng)細胞，采用 qPCR 方法檢測了脾細胞炎性細胞因子的表達。結(jié)果（圖 4，圖 5）發(fā)現(xiàn)，與 4T1 共培養(yǎng)后，脾臟細胞 Th1 和 Th2 細胞因子的表達均降低；4T1.Null 和 4T1.DCN 可以促進 Th2 和部分Th1（IL-2）細胞因子的表達；4T1.DCN 的促進作用更明顯。

2.5 4T1.DCN 調(diào)節(jié)小鼠脾臟細胞殺傷相關(guān)基因表達

細胞共培養(yǎng) 3 d，收集培養(yǎng)細胞，采用 qPCR 方法檢測了穿孔素和顆粒酶 B 的表達。結(jié)果（圖 6）顯示，4T1 可以抑制這兩種殺傷相關(guān)基因的表達；4T1.Null 和 4T1.DCN 可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的這種抑制作用，恢復脾臟細胞的殺傷功能。

3 討論

腺病毒是免疫基因治療的重要載體，在多種腫瘤的治療中發(fā)揮著重要作用。眾所周知，TGF-β 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和進展過程中具有雙重作用。在腫瘤晚期，TGF-β 信號被激活，可以通過多種機制促進腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[11-14]。Decorin 是 TGF-β信號的天然抑制劑，因此，可以作為治療晚期和轉(zhuǎn)移癌的潛在研究對象[15]。已經(jīng)證實Decorin 在各種晚期癌癥患者的腫瘤組織中表達下調(diào)，而恢復 Decorin 的表達已成為一種潛在的治療策略[2, 16-19]。

圖 2 小鼠脾臟細胞 CD4+和 CD8+細胞比例

Figure 2 The percentage of CD4+and CD8+cells of mouse splenocyte

圖 3 小鼠脾細胞記憶 T 細胞（A）和 Treg 細胞（B）比例（*P < 0.05，**P < 0.01，vs. control；#P < 0.05，vs. 4T1）

Figure 3 Percentage of Tm (A) and Treg (B) in splenocyte after different stimulations (*< 0.05,**< 0.01, vs. control;#< 0.05, vs. 4T1)

Figure 4 mRNA expressions of Th1 cytokines in splenocyte (**< 0.01,***< 0.001 vs control;#< 0.05,##< 0.01,###< 0.001 vs. 4T1)

圖 5 Th2 類細胞因子表達（*P < 0.05，***P < 0.001 vs control；#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001 vs 4T1)

Figure 5 mRNA expressions of Th2 cytokines in splenocyte (*< 0.05,***< 0.001 vs control;#< 0.05,##< 0.01,###< 0.001 vs 4T1)

圖 6 小鼠脾臟細胞穿孔素和顆粒酶 B 的表達（***P < 0.001 vs control；###P < 0.001 vs 4T1)

Figure 6 The expression of perforin and granzyme B in mouse splenocyte (***< 0.001 vs control；###< 0.001 vs 4T1)

據(jù)報道，TGF-β 是調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的一個重要分子。高 TGF-β 水平可以抑制效應細胞的成熟，如 Th 細胞、樹突狀細胞和 NK 細胞，以及誘導 M2 巨噬細胞的極化。此外，TGF-β 也可以調(diào)節(jié)細胞因子和趨化因子的表達來調(diào)節(jié)抗腫瘤炎癥反應和推動 Th1-Th2 平衡向 Th2 免疫表型轉(zhuǎn)化[20-22]。本研究表明，Decorin 對 Th 細胞因子、穿孔素和顆粒酶 B 均具有調(diào)節(jié)作用，尤以對 IL-2、IL-10、IFN-γ、TGF-β、穿孔素和顆粒酶的調(diào)節(jié)作用最為明顯。TGF-β mRNA 表達升高，我們推測與Decorin 抑制 TGF-β 信號后的代償性表達升高有關(guān)，但仍需要進一步試驗證實。

臨床前研究表明，抗 TGF-β 抗體和小分子靶向 TGF-β 信號均可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，如恢復 CD8+T 淋巴細胞的細胞毒性，增強樹突狀細胞的抗原呈遞能力和減少CD4+CD25+Treg 細胞的百分比[23-26]。本研究中雖然 CD4+T 細胞和 CD8+T 淋巴細胞的比例與對照組相比并無統(tǒng)計學差異，但是 CD4+T 細胞的亞群發(fā)生了顯著改變，與免疫抑制相關(guān)的 Treg 細胞比例明顯降低，與免疫記憶相關(guān)的 Tm 細胞比例明顯升高，表明 Decorin 很好地調(diào)節(jié)了免疫細胞的抗腫瘤活性。

綜上所述，本研究證明了 Decorin 可以增強乳腺癌細胞系對小鼠脾臟細胞的免疫激活作用。其可以通過抑制 Treg 細胞的比例，改善腫瘤微環(huán)境的抑制；通過增加 Tm 細胞的比例，增強機體的抗腫瘤免疫；通過調(diào)節(jié) Th 細胞因子的表達，達到調(diào)節(jié)免疫的作用；還可以通過增加穿孔素和顆粒酶的表達，增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。

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Decorin promotes the immune response of mouse splenocytes in response to breast cancer cell line 4T1

ZHAO Hui-qiang, LIU Chao, HU Ze-bin, DAI Shi-yun, WANG Hua

We aim to evaluate the immune activation effect of breast cancer cell line 4T1 with Decorin overexpression on the mouse splenocytes, and thus identify the immunological regulation of Decorin on anti-tumor immunity.

Mouse breast cancer cell line 4T1 was infected by adenovirus expressing Decorin, and then cocultured with mouse splenocytes for 3 days. By FACS analysis, the percentage of CD4+T cells, CD8+T cells, memory T cell (Tm) and Treg were detected. Real-time PCR was used to detect the mRNA expression of Th1 cytokines IL-2, IL-12, TNF-α and IFN-γ, Th2 cytokines IL-4, IL-6, IL-10 and TGF-β, and cytotoxic related genes perforin and granzyme B, after coculture with 4T1 wild type cells, 4T1.Null (adenovirus infection conrtol) and 4T1.DCN (with Decorin overexpression).

Though the percentage of CD4+T, CD8+T and Treg cells were not significantly changed in splenocytes cocultured with 4T1 wild type cells, the subsets of Tm were increased.Meanwhile, themRNA expression of cytokines, perforin and granzyme B were decreased in the splenocytes coculture with 4T1 wild type cells. However, in the 4T1.DCN and 4T1.Null group, the percentage of Treg were decreased, and the suppressed expression of Th1 and Th2 related cytokinesas well as perforin and granzyme B were partly reversed as compared with the 4T1 wild type group. 4T1-DCN group exerted more significant effect than 4T1.Null group.

Decorin may positively regulate the immune response of splenocytes upon stimulation by breast cancer cell line 4T1.

Decorin; Breast neoplasms; Genes, MHC class II; Splenocyte; 4T1 cells

WANG Hua, Email: 18511712135@163.com; HU Ze-bin, Email: 94535226@qq.com

100850 北京，軍事科學院軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所（趙慧強、戴詩云、王華）；100048 北京，中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心干部保健科（趙慧強）；264003 山東，濱州醫(yī)學院臨床醫(yī)學院（劉超）；100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑所（胡澤斌）

Author Affiliations: Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Academy of Military Sciences, Beijing 100850, China (ZHAO Hui-qiang, DAI Shi-yun, WANG Hua); Department of Cadre Health Care, The Sixth Medical Center of PLA General Hospital, Beijing 100048, China (ZHAO Hui-qiang); School of Clinical Medicine, Binzhou Medical University, Shandong 264003, China (LIU Chao); Institute for In Vitro Diagnostic Reagents Control, National Institute for Food and Drug Control, Beijing 100050, China (HU Ze-bin)

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.06.001

北京市科技新星計劃（Z171100001117118）

王華，Email：18511712135@163.com；胡澤斌，Email；945352226@qq.com

2019-10-11