宮偉，李濤

論著

利用生物信息學分析鑒定鼻咽癌轉移的信號通路及核心基因

宮偉，李濤

利用基因芯片技術和生物信息學分析方法，篩選出鼻咽癌轉移相關的核心基因和相關信號通路，為尋找鼻咽癌轉移早期診斷和靶向治療潛在標志物提供依據。

GSE103611 的表達芯片從 Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫中下載，該數據庫中包含 48 個樣本，包括 24 個原發(fā)鼻咽癌樣本和 24 個放療后轉移的鼻咽癌樣本。整理微陣列數據集獲得差異表達基因（DEGs）與本課題組前期構建的相對于 CNE-2 侵襲轉移能力更強的 CNE-2SI 細胞對比芯片差異基因進行比對獲得共同差異基因。利用基因本體論（GO）和京都百科全書基因和基因組數據庫（KEGG）對共同差異基因進行富集并利用 DAVIDE 在線進行分析。共同差異基因的蛋白質互作（PPI）網絡由 STRING 數據庫構建。Hub 基因分析通過 Cytoscape 軟件中的 cytoHubba 插件制作。關鍵基因的生存分析通過 Kaplan Meier-plotter 數據庫分析獲得。

GSE103611 數據集中共鑒定出差異基因共 3301 個，其中上調 506 個，2795 個基因被下調。本課題組的芯片中差異基因共 2691 個，其中上調 1349 個，1342 個基因被下調。兩個芯片共同上調基因 47 個，下調基因 135 個，共計 182 個。GO 分析表明共同差異基因的生物學功能主要集中在基本的生物學過程和細胞黏附；主要的細胞成分包括細胞膜和細胞質；分子功能包括 ATP 結合等（< 0.05）。KEGG 通路分析顯示這些共同差異基因主要參與脂類代謝、MAPK 信號通路和細胞黏附信號通路（< 0.05）。CytoHubba 插件分析從 PPI 網絡中找到前 20 個具有高度關聯(lián)性的核心基因。生存分析發(fā)現(xiàn) CXCL10、CUL7、PLCB2 可能與在鼻咽癌不良預后相關（< 0.05）。

利用生物信息學分析篩查鼻咽癌轉移相關 DEGs 和通路可以幫助了解鼻咽癌轉移發(fā)生的分子機制，對鼻咽癌轉移的早期診斷具有臨床意義。

鼻咽腫瘤； GEO 數據庫； 腫瘤轉移

復發(fā)和轉移是鼻咽癌患者預后差的主要原因[1]。腫瘤的轉移歷經上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、定向侵襲、侵入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)、滲出脈管并形成微轉移灶和定植的過程[2]。在 EMT 過程中，一些細胞可獲得有助于腫瘤細胞轉移的腫瘤干細胞樣特性[3]。本課題組前期通過無血清懸浮培養(yǎng) CNE-2 細胞獲得鼻咽癌腫瘤干細胞亞群，并血清誘導其分化成 CNE-2SI 細胞[4]。CNE-2SI 與 CNE-2 相比細胞侵襲能力明顯增強。探究其發(fā)生機制，用基因芯片技術檢測兩者的基因表達，并利用生物信息學的手段對兩種細胞差異表達基因分析。GEO 數據庫中 GSE103611 是 24 個原發(fā)與 24 個放療后轉移的臨床鼻咽癌組織芯片。通過比對兩芯片，篩選出與鼻咽癌轉移發(fā)生、發(fā)展相關的核心基因并進行綜合分析。為將來臨床上提高鼻咽癌患者診斷率以及針對新的靶點開發(fā)防治鼻咽癌轉移的更高效的治療藥物奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 鼻咽癌分化細胞株 CNE-2SI 由本實驗室構建。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和 0.25% Trypsin-EDTA 購自美國 Gibco 公司；Transwell 小室和基質膠購自美國 Corning 公司。

1.1.2 數據來源 鼻咽癌及鼻咽癌轉移芯片表達譜下載自美國國立生物技術信息中心 NCBI-GEO DataSet 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov），編號為 GSE103611。其中包括 24 個原位鼻咽癌樣本及 24 個放療后轉移的鼻咽癌樣本。直接下載其矩陣文件，通過 R 軟件處理數據將其去除重復的基因，保留每個基因最大表達量結果。選取|log2fc| > 1，< 0.05 的差異基因進行后續(xù)分析。CNE-2SI 與 CNE-2 之間對比基因表達芯片制作及差異基因分析由博奧生物有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細胞遷移實驗 將 CNE-2 和 CNE-2SI 細胞數調整為 5 × 105個/ml，加 200 μl 細胞懸液于已經水化的侵襲小室上室。培養(yǎng) 6 h 后用棉簽擦去上層膠和未遷移細胞，4% 多聚甲醛固定 15 min 后用0.1% 結晶紫染色 15 min，PBS 清洗。倒置顯微鏡隨機選取 10 個視野，拍照后計數細胞數。采用 SPSS 19.0 對數據進行統(tǒng)計學分析。數據符合正態(tài)分布，兩組比較用檢驗，< 0.05 具有統(tǒng)計學意義。

1.2.2 篩選共同差異基因及 GO 和 KEGG 途徑富集 將 GSE103611 上調差異基因和下調差異基因與本課題組芯片相應差異基因進行比對，篩選出共同上調、下調差異基因用于進一步分析。對共同差異基因使用 DAVIDE 數據庫（https://david. ncifcrf.gov/）進行 GO 功能注釋及 KEGG 途徑分析。在本研究中，我們將差異基因共同分析，< 0.05 被認為具有統(tǒng)計學意義。

1.2.3 蛋白質互作網絡（PPI） String 數據庫（http://string-db.org）常用于描述經實驗驗證和預測的蛋白質之間相互作用關系，用來全面整體分析蛋白質之間的生物信息學分析；Cytoscape 軟件（http://www.cytoscape.org/）是一種可視化軟件，可以將生物分子之間的相互作用關系更加形象直觀地描述出來。每個節(jié)點是一個基因、蛋白質或分子，節(jié)點間的連接表示這些生物分子之間的相互作用。而其插件“cytoHubba”可以通過計算每個節(jié)點與其他節(jié)點的關聯(lián)強度，進一步篩選出共同差異基因中的核心基因。

圖 1 CNE-2 與CNE-2SI 的遷移能力及差異基因熱圖[A：Transwell 實驗比較CNE-2 與CNE-2SI 的遷移能力；B：穿過基質膜的CNE-2 與CNE-2SI 細胞數比較；C：CNE-2 與CNE-2SI 的差異基因熱圖（|log2fc| > 1 且P < 0.05），紅色代表基因表達上調，綠色代表基因表達下調，黑色表示沒有顯著差異變化（2-1、2-2、2-3：CNE-2 細胞的差異基因（重復檢測 3 次）；2S-1、2S-2、2S-3：懸浮培養(yǎng) CNE-2 細胞獲得的干細胞亞群的差異基因；2S-24h、2S-48h、2S-72h：血清誘導干細胞亞群分化的不同時間點的差異基因（每時間點重復檢測3次）；2S-7d-1、2S-7d-2、2S-7d-3：CNE-2SI 細胞的差異基因（重復檢測 3 次）]

Figure 1 Migration capability and differential gene heat map of CNE-2 and CNE-2SI [A: Tranwell cell invasion experiment; B: The number of CNE-2 and CNE-2SI cells across the matigel basement membrane; C: Differential gene heat map of CNE-2 and CNE-2SI (|log2fc| > 1 and< 0.05). Red indicates up-regulation of gene expression, green indicates relative down-regulation of differential gene expression, and black indicates no significant change in gene expression (2-1 to 2-3: differential genes in CNE-2 cells; 2S-1 to 2S-3: differential genes in stem cell subpopulations obtained from suspension culture of CNE-2 cells (repeated detection for 3 times); 2S-24h, 2S-48h and 2S-72h: differential genes at different time points of serum induced stem cell subpopulation differentiation (repeat the test 3 times at each time point); 2S-7d-1 to 2S-7d-3: differential genes in CNE-2SI cells]

1.2.4 Hub 基因的生存分析 cytoHubba 插件篩選出的前 20 個 Hub 基因對頭頸部腫瘤預后的影響用 Kaplan Meier-plotter 數據庫（http://kmplot. com/analysis/）分析獲得。

2 結果

2.1 CNE-2SI 相較于 CNE-2 有更強的遷移能力

Tranwell 實驗研究結果顯示，CNE-2 細胞與 CNE-2SI 細胞均由上室穿過聚碳酸酯膜到下室。CNE-2 穿過基質膜細胞數為（25 ± 4.04），CNE-2SI 穿過基質膜細胞數為（163 ± 14.2）。兩獨立樣本檢驗分析顯示 CNE-2SI 的侵襲能力明顯強于 CNE-2（= 9.33，< 0.01），如圖 1 所示。

2.2 芯片數據信息共同差異基因

GSE103611 數據集中共鑒定出差異基因3301 個，其中上調 506 個，2795 個基因被下調。本課題組的芯片中差異基因共 2691 個，其中上調 1349 個，1342 個基因被下調。兩個芯片共同上調基因 47 個，下調基因 135 個，共計 182 個。如圖 2 所示。

2.3 共同差異基因的 GO 功能富集及 KEGG 通路分析

使用 DAVIDE 在線分析數據庫分析兩芯片 182 個共同差異基因進行生物學功能注釋及通路富集。其中 GO 功能注釋包括生物過程、細胞組成及分子生物學功能。將獲得的數據導入在線畫圖軟件 imageGP（http://www.ehbio.com/ImageGP/index. php/Home/Index/index.html），結果如圖 3 所示。分析顯示共同差異基因的生物學功能主要集中在基本的生物學過程和細胞黏附（表 1），主要的細胞成分包括細胞膜和細胞質，分子功能包括 ATP 結合等（< 0.05）。KEGG 通路分析顯示這些共同差異基因主要參與脂類代謝、MAPK 信號通路和細胞黏附信號通路（表 2）（< 0.05）。

圖 2 篩選鼻咽癌轉移相關差異基因（A：CNE-2SI 與CNE-2 差異基因火山圖；B：GSE103611 差異基因火山圖，x 軸代表對數轉換后的P值，y 軸代表基因表達的平均差異。注：兩個火山圖顯示了所有DEG；灰點表示樣本之間不存在差異表達的基因，綠點和紅點分別表示樣本中下調和上調的基因。|log2fc| > 1 和P < 0.05 被設定為截止標準；C：GSE103611 和CNE-2SI 數據集上調DEG 的交叉點；D：GSE103611 和CNE-2SI 數據集下調DEG 的交叉點。相交的DEG 被定義為共同的DEG）

Figure 2 Identification of significant differentially expressed genes (DEGs) in nasopharyngeal carcinoma (A: Volcano plot showing the DEGs identified from our microarray; B: Volcano plot showing the DEGs identified from GSE103611. x axis represents log transformedvalue, and y axis indicates the mean expression differences of genes. Note: The two volcano plots showed all of the DEGs; the grey dots represent genes that are not differentially expressed and the green dots and red dots represent the down-regulated and up-regulated genes in nasopharyngeal carcinoma samples, respectively. |log2fc| >1 and< 0.05 were set as the cut-off criteria; C: The intersection of up-regulated DEGs of CNE-2SI and GSE103611 datasets; D: The intersection of down-regulated DEGs of CNE-2SI and GSE103611 datasets. The intersected DEGs were defined as the common DEGs)

2.4 PPI 網絡篩選關鍵核心基因及其預后分析

為了進一步了解差異基因間的相互作用關系，用 String 軟件對共同差異基因進行網絡互作分析。并將結果導入到 Cytoscape 軟件中將其可視化（圖 4）。并用 cytoHubba 插件計算每個節(jié)點與其他節(jié)點的關聯(lián)強度，進一步篩選出共同差異基因中的核心基因（IRF6、OAS1、CXCL10、CUL7、HERC6、KBTBD7、HACE1、PJA1、HERC3、ISG15、MYO6、PLCB2、MGLL、LGALS3、EGFR、CDH1、ITGA6、LAMA3、LAMB3、COL17A1）。

2.5 核心基因的預后分析

在對 20 個核心基因在頭頸部鱗癌中進行預后分析發(fā)現(xiàn)，CXCL10（= 0.014）、CUL7（= 0.048）、PLCB2（= 0.0003）的低表達與頭頸部鱗癌的不良預后相關，如圖 5 所示。

圖 3 GO 功能富集以及KEGG 通路富集[A：生物過程（前20）；B：細胞成分；C：分子功能；D：KEGG 途徑；圖中的圓圈顏色改變指示P值的變化，圓圈的大小表示功能中差異基因富集的數量]

Figure 3 GO function enrichment and KEGG pathway enrichment [A: Biological process (top 20); B: Cellular component; C: Molecular function; D: KEGG pathway; the circle color change in the figure indicates the change ofvalue, and the circle size change indicates the richness of DEGs in function number of sets]

表 1 GO:0007155 細胞黏附 term 中的共同差異基因

表 2 差異基因 KEGG 通路富集

圖 4 Cytoscape 軟件對蛋白質相互作用可視化（方塊代表差異基因，線條代表基因之間的相互作用，黃色至紅色代表關聯(lián)強度前20 的基因，顏色越深關聯(lián)強度越強）

Figure 4 Cytoscape visualizes protein interactions (squares represent differentially expressed genes, lines represent interactions between genes, and colors from yellow to red represent the top 20 genes with stronger correlation, with darker colors showing stronger correlation)

ABC

Figure 5 Effect of Hub gene on survival of patients with head and neck carcinoma (A: CXCL10,= 0.014; B: CUL7,= 0.048;C: PLCB2,= 0.0003)

3 討論

鼻咽癌是我國華南地區(qū)常見的腫瘤之一，缺乏對復發(fā)及轉移的有效控制是患者存活率下降的主要原因。放療目前是鼻咽癌治療的主要手段，但是研究發(fā)現(xiàn)放療可引起癌細胞的局部復發(fā)和遠處轉移[5]。電離輻射（IR）以不同的方式促進癌細胞的存活和侵襲，包括促進上皮間質轉化（EMT）、促進腫瘤干細胞（CSCs）和改變腫瘤微環(huán)境

（TME）[6]。因此，本文通過將課題組芯片與臨床樣本芯片進行對比，利用生物信息學方法與基因芯片技術的有機結合，可以宏觀、整體地觀察鼻咽癌轉移的相關基因。為快速尋找鼻咽癌靶點及相關調控通路提供可能。

本研究通過 Transwell 實驗發(fā)現(xiàn) CNE-2SI 細胞的遷移能力明顯高于 CNE-2。比對實驗室兩者表達芯片結果，篩選 |log2fc| > 1 且< 0.05 的差異表達基因共 2691 個，其中上調 1349 個，1342 個基因被下調。比對 GEO 數據庫中 GSE103611芯片，兩個芯片共同上調基因 47 個，下調基因 135 個，共計 182 個。將共同差異基因進行 GO 功能富集及 KEGG 通路富集。GO 分析表明共同差異基因的生物學功能主要集中在細胞黏附。細胞表面黏附于細胞外基質是組織完整性的基礎[7]，不僅包含細胞與細胞外基質的黏附也包含細胞與細胞之間的黏附。黏附結構的破壞是細胞遷移的重要步驟之一[8]。細胞黏附力下降和運動功能的增強便于腫瘤細胞逃離原發(fā)部位，發(fā)生轉移[9]。本研究得到的結果與已報道的鼻咽癌轉移密切相關[10-11]。KEGG 通路分析顯示這些共同差異基因主要參與脂類代謝、MAPK 信號通路和細胞黏附信號通路。文獻[12]報道脂類代謝的異常與鼻咽癌增殖轉移相關。MAPK 信號通路參與細胞增殖、分化和遷移等多種功能。之前的研究發(fā)現(xiàn) MAPK 信號通路的過度激活可誘導 EMT 和鼻咽癌細胞的侵襲[13]。

本文還構建了共同差異基因的 PPI 網絡，并篩選了前 20 的核心基因：IRF6、OAS1、CXCL10、CUL7、HERC6、KBTBD7、HACE1、PJA1、HERC3、ISG15、MYO6、PLCB2、MGLL、LGALS3、EGFR、CDH1、ITGA6、LAMA3、LAMB3、COL17A1。其中 CXCL10（= 0.014）、CUL7（= 0.048）、PLCB2（= 0.0003）的低表達與頭頸部鱗癌的不良預后相關。CXCL10 基因編碼一種細胞因子，在 CXCL9、-10、-11/CXCR3 軸中調控免疫細胞遷移、分化和活化，發(fā)揮腫瘤抑制功能[14]。因此 CXCL10 的低表達對免疫細胞的刺激減弱，很可能間接促進腫瘤的轉移。CUL7 基因編碼的蛋白是 E3 泛素蛋白連接酶復合物的組成部分，研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中 CUL7 的高表達有促瘤作用[15]。PLCB2基因編碼的蛋白是一種磷酸二酯酶，在多種腫瘤的侵襲和轉移中的作用[16]。

綜上所述，利用生物信息學的方法將鼻咽癌細胞系芯片與 GEO 數據庫臨床樣本芯片相比對，尋找出與細胞轉移相關的差異表達基因及可能涉及的調控通路。其部分基因經文獻檢索已報道。這些發(fā)現(xiàn)增加了對鼻咽癌遠處轉移的發(fā)病機制及分子機制的理解，對鼻咽癌的早期診斷和預防具有重要的臨床意義。因此證明生物信息學分析有望為日后腫瘤發(fā)病機制研究以及診治方法提供新的策略。

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Identification of signaling pathways and core genes in nasopharyngeal carcinoma metastases using bioinformatics analysis

GONG Wei, LI Tao

To provide a basis for the early diagnosis and targeted therapy potential markers of NPC metastasis, the core genes and related signal pathways related to NPC metastasis were screened out using gene chip technology and bioinformatics analysis method.

The expression profile of GSE103611 was downloaded from the Gene Expression Omnibus (GEO) database, which contained 48 samples including 24 NPC primary tumor samples and 24 NPC metastatic tumor samples. Microarray datasets were sequenced to obtain differentially expressed genes (DGEs). Common differentially expressed genes were obtained by comparison with the differentially expressed genes in contrast chips of the CNE-2SI cells constructed by our research group in the earlier stage, which were more capable of invasion and metastasis than CNE2. Gene ontology and DGEs enrichment of the Kyoto Encyclopedia Gene and Genome (KEGG) pathway were performed by DAVID online analysis. DGE’s protein-protein interaction (PPI) network was constructed from the STRING database. Hub gene analysis was made using the cytoHubba plugin in Cytoscape software. Survival analysis of key genes was obtain via Kaplan Meier-plotter database.

A total of 3301 differential genes were identified in the GSE103611, of which 506 genes were up-regulated and 2795 genes were down-regulated. There were 2691 differential expressed genes in our microarray, of which 1349 genes were up-regulated and 1342 genes were down-regulated. 47 up-regulated and 135 down-regulated common DEGs were identified, respectively. GO analysis indicated that the biological function of total 182 common DGEs were mainly concentrated in basic biological process and cell adhesion. The main cellular components include plasma membrane part and cytosol. Molecular functions included ATP binding. KEGG pathway analysis revealed that these DGEs were mainly involved in the glycerolipid metabolism signaling pathway, MAPK signaling pathway and cell adhesion molecules (CAMs) signaling pathway. Top 20 hub gene were screened out by cytoHubba plugin in Cytoscape software. Among the top 20 hub genes, 3 down-regulated hub genes (CXCL10, CUL7, PLCB2) had significant prognostic values in head and neck squamous cell carcinoma.

Bioinformatics analysis of DEGs and pathways related to nasopharyngeal carcinoma metastasis can help to understand the molecular mechanism of nasopharyngeal carcinoma metastasis, which has clinical significance for the early diagnosis of nasopharyngeal carcinoma metastasis.

Nasopharyngeal neoplasms; GEO data; Neoplasm metastasis

LI Tao, Email: 59889906@qq.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.06.002

國家自然科學基金（31171351）

523808 東莞，廣東醫(yī)科大學廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室

李濤，Email：59889906@qq.com

Author Affiliation: Provincial Key Laboratory of Medical Molecular Diagnostics, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, China

2019-07-26