韋敬錫，凌永嫦，閆位娟

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，北京 100088）

0 引言

宮頸癌是女性最常見的婦科癌癥，嚴(yán)重威脅女性健康，其最主要的病因?yàn)楦呶Ｈ巳轭^瘤病毒侵襲，大多數(shù)侵襲性宮頸癌發(fā)生前存在宮頸發(fā)育不良或原位癌[1]。作為高發(fā)疾病，2008 年全球發(fā)病率估計(jì)為53 萬(wàn)例，約有85%的病例發(fā)生在發(fā)展國(guó)家[2,3]。宮頸癌具有癌癥的普遍特點(diǎn)——腫瘤細(xì)胞易轉(zhuǎn)移，這是導(dǎo)致宮頸癌治療失敗和死亡的主要原因，目前隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)新的分子生物學(xué)治療方法，為臨床研究提供新的思路。最近有研究表明微小RNA(miRNAs)與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)[4]，可以通過(guò)特異性與靶mRNA 相互作用，調(diào)控細(xì)胞功能并在腫瘤及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的病理中異常表達(dá)，為腫瘤轉(zhuǎn)移的研究開辟新的途徑[5]。miR-424 作為一種抑癌因子，已被發(fā)現(xiàn)在宮頸癌患者中其存在下調(diào)的現(xiàn)象，但其作用及機(jī)制仍不清楚[6]。有研究報(bào)告認(rèn)為miRNA 對(duì)于細(xì)胞的作用，是通過(guò)參與Wnt/β-catenin 信號(hào)通路作用于靶基因從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖遷移，但仍需高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明[7]。對(duì)此我們認(rèn)為miR-424 可能通過(guò)調(diào)控Wnt 蛋白（Wnt8A）的表達(dá)負(fù)調(diào)控Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，擬研究miR-424 對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及其對(duì)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路調(diào)節(jié)的機(jī)制，以尋求新的治療方法。

1 材料與方法

圖1 技術(shù)路線流程圖

1.1 miR-424 對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

1.1.1 主要試劑

人宮頸癌細(xì)胞HeLa 購(gòu)于美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)；miR-424 的高效模擬物（mimic）、抑制物（inhibitor）、陰性對(duì)照組（negative control,NC）；高糖型DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；Transwell 小室及基質(zhì)膠；PBS 緩沖液；蘇木素染色液；Boyden 小室；趨化劑Fibronectin；Trizol 試劑盒。

1.1.2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱；熒光顯微鏡。

1.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞培養(yǎng)在5 % CO2培養(yǎng)箱中，溫度37.5 ℃，百分之百相對(duì)飽和濕度，培養(yǎng)基為高糖型DMEM 培養(yǎng)基+PBS 緩沖液，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞接種至6 孔板（5×106/孔）中，第二天細(xì)胞融合度達(dá)70-80 %時(shí)，轉(zhuǎn)染miR-424 mimic/inhibitor/NC，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞遷移能力

將細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞接種至6 孔板中，培養(yǎng)48 小時(shí)后，使用槍頭在6 孔板內(nèi)進(jìn)行劃痕操作，再用PBS 緩沖液沖細(xì)胞3 次，去除劃下的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。后在顯微鏡下拍照記錄，分別在每孔選擇4-6個(gè)視野紀(jì)錄距離，并按照0、6、12、24 時(shí)間點(diǎn)取樣。

1.1.5 Transwell 小室法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力

實(shí)驗(yàn)開始前將Transwell 小室聚碳酸酯微孔膜用PBS 緩沖液浸濕，將基質(zhì)膠鋪于小室微膜上。將培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以每孔105 個(gè)接種于小室的上室，將FBS 緩沖液加入到下室中作為培養(yǎng)液，后放入培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。顯微鏡下管道細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況，轉(zhuǎn)移多時(shí)，取PBS 緩沖液沖洗3 次，再使用蘇木素染色液染色。取出聚碳酸酯微孔膜后在顯微鏡下觀察隨機(jī)的5 個(gè)視野穿過(guò)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其平均值作為細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的代表。

1.1.6 宮頸癌癌細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)

取2×105個(gè)細(xì)胞懸浮于鋪有Matrigel 50 g 的Boyden 小室的上室中，下室加有趨化劑Fibronectin 10g，在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h 后，以棉簽擦盡膜上室面的細(xì)胞，HE 染色，光鏡下記數(shù)膜上5 個(gè)視野中細(xì)胞數(shù)。

1.2 在細(xì)胞中驗(yàn)證miR-424 對(duì)所預(yù)測(cè)靶基因的作用

1.2.1 預(yù)測(cè)

根據(jù)targetscan、starbase、miRanda 多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果的交集，選擇參與β-catenin 信號(hào)通路有關(guān)的基因Wnt8Aa 為預(yù)測(cè)靶基因。

1.2.2 在細(xì)胞中驗(yàn)證miR-424 對(duì)所預(yù)測(cè)靶基因的作用

（1）載體構(gòu)建：從人基因組 DNA 中PCR 擴(kuò)增Wnt8a 3,UTR 片段，PCR 產(chǎn)物純化后，雙酶切克隆到質(zhì)粒載體，酶切鑒定正確的克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證；

（2）分別將不同克隆的報(bào)告基因載體和miR-424 mimic/inhibitor 在liper3000 作用下共轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞；

（3）按照Promega 提供的熒光素酶分析檢測(cè)說(shuō)明，分別對(duì)上述兩種不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24-48 小時(shí)后，進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。

1.3 miR-424 對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用機(jī)制研究

常規(guī)方法培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染前一天，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，均勻鋪于6 孔板中(5×106/孔)。次日，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到75-80%融合時(shí)，細(xì)胞分成三組，一組導(dǎo)入無(wú)關(guān)序列(negative control,NC)，一組導(dǎo)入miR-424 inhibitor，一組不處理，為對(duì)照組；熒光倒置顯微鏡觀察照射前后細(xì)胞形態(tài)。

1.3.1 RT-PCR 檢測(cè)

提取細(xì)胞的總RNA，使其逆轉(zhuǎn)錄為c DNA 并擴(kuò)增，檢測(cè)處理后細(xì)胞中Wnt8a、β-catenin 和VEGF mRNA 表達(dá)水平。

1.3.2 Western Blot 檢測(cè)

將細(xì)胞接種至6 孔板后，培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞刮取并離心處理，加入細(xì)胞裂解液，離心后取上清液為總蛋白，再將其煮沸變性后取30 ng 樣品，進(jìn)行電泳，再加入細(xì)胞溶液孵育2 小時(shí)，凝膠成像，檢測(cè)處理后細(xì)胞中WNT8A、β-catenin 和VEGF 的蛋白表達(dá)水平。

1.3.3 細(xì)胞總RNA 的提取

用TRIzol 法提取宮頸癌細(xì)胞或?qū)m頸癌組織的總RNA,按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行總RNA 提取，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度：OD260/280 ≥1.8。

1.3.4 莖環(huán)法qRT-PCR 檢測(cè)miRNA

按照TaqMan miRNA 分析試劑盒（ABI PRISM）操作說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用t 檢驗(yàn)分析兩組之間數(shù)據(jù)差異性，以P＜0.05 表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 miR-424 對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

利用Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力進(jìn)行測(cè)定結(jié)果與miR-424NC 組(22.45±3.25) 比較，miR-424inhibitor 組(3.48±0.36) 細(xì) 胞 遷移距離降低(P ＜0.010）侵襲數(shù)目，與miR-424NC組(165.78±12.15) 比較，miR-424inhibitor組(36.54±2.35)細(xì)胞侵襲數(shù)目降低(P＜0.01)。

2.2 在細(xì)胞中驗(yàn)證miR-424 對(duì)所預(yù)測(cè)靶基因的作用

與miR-424 NC 組比較，miR-424 inhibitor 組VEGF mRNA 表達(dá)量下調(diào)，β-catenin 表達(dá)量下調(diào)，差異具有顯著性（P＜0.01）。

3 討論

近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明miR-424 在腫瘤組織的下調(diào)可能與腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。在大多數(shù)腫瘤中，miR-424 的表達(dá)下降，這使得細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯升高。Chitose Oneyama 等[8]認(rèn)為miR-424 的再表達(dá)抑制了腫瘤細(xì)胞的致病性和侵襲性。Xu J 等[6]通過(guò)研究147 例宮頸癌患病者同樣發(fā)現(xiàn)miR-424 低表達(dá)且與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移呈明顯負(fù)相關(guān)。同時(shí)，miR-424 與腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡有關(guān)。Binghai Chen等[9]證明miR-424 可以通過(guò)誘導(dǎo)Chk1 的抑制和磷酸化，調(diào)控WEE1 和Cdc25c 磷酸化，使其表達(dá)下調(diào)進(jìn)而抑制腎癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡。Lei Yu 等[10]也通過(guò)定量RT-PCR 分析證實(shí)了miR-424 在肝細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞和組織中表達(dá)下調(diào)，而其過(guò)表達(dá)降低了肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

目前對(duì)于miR-424 抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷移及侵襲的作用機(jī)制尚不明確，臨床有多種研究對(duì)其進(jìn)行推測(cè)。有研究認(rèn)為miR-424 的這種作用與其靶點(diǎn)c-Myb 有關(guān)。c-Myb 是一種中藥的前侵襲分子，作為miR-424 的直接靶點(diǎn)，該研究證明c-Myb 是miR-424 的功能下游靶點(diǎn)，其過(guò)表達(dá)抑制了mir -424 在肝癌細(xì)胞中的增殖和侵襲[10]。Piao L等[11]則認(rèn)為miR-424 可以通過(guò)抑制YAP1 的表達(dá)而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。YAP1 是經(jīng)典Hippo-YAP 信號(hào)通路的主要效應(yīng)蛋白和靶蛋白，有研究證明在腫瘤組織和細(xì)胞中其表達(dá)水平顯著增高[12]。也有研究報(bào)告認(rèn)為miRNA 對(duì)于細(xì)胞的作用，是通過(guò)參與Wnt/β-catenin 信號(hào)通路作用于靶基因從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖遷移，但仍需高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明[8]。

依據(jù)上述理論，我們猜測(cè)miR-424 可能通過(guò)調(diào)控Wnt 蛋白（Wnt8A）的表達(dá)負(fù)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，在本研究中，首先設(shè)計(jì)出了技術(shù)流程路線（見圖1），并一一驗(yàn)證。結(jié)果表明，miR-424 inhibitor 組細(xì)胞侵襲數(shù)目降低、VEGF mRNA表達(dá)量下調(diào)、β-catenin表達(dá)量下調(diào)(P＜0.01)。與設(shè)想相符。綜上所述，我們初步認(rèn)為miR-424 對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移及增殖的作用機(jī)制可能通過(guò)抑制WNT8A 表達(dá)，阻斷wnt/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)一步通過(guò)抑制VEGF 表達(dá)抑制惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。