胡玲瓏 溫正旺 俞佳珂 陳潔 石海礬 陳均亞 余金生 陳益平

Toll樣受體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與HBV、HCV的肝損 傷密切相關(guān)[1-2]。單免疫球蛋白-白細(xì)胞介素1受體相關(guān)蛋白（single immunoglobulin interleukin-1 receptor related，SIGIRR）是最近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)Toll樣受體超家族成員，是Toll樣受體信號(hào)通路中的負(fù)性調(diào)控分子，起著一個(gè)免疫反應(yīng)剎車制動(dòng)器樣的作用。有研究發(fā)現(xiàn)它參與了肝臟的炎癥反應(yīng)[3]。原發(fā)性EB病毒感染患兒，80%左右可出現(xiàn)肝損傷[4]；而這些患兒的臨床癥狀多在治療1周后好轉(zhuǎn)[5]。SIGIRR是否參與EB病毒感染后導(dǎo)致的肝損傷，目前尚未明確。本研究通過檢測(cè)原發(fā)性EB病毒感染患兒血液單核細(xì)胞中SIGIRR的表達(dá)情況，以探討這一指標(biāo)在損傷中的臨床意義。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2018年1至12月在本院住院治療的40例原發(fā)性EB病毒感染患兒為A組，入院時(shí)EB-IgM和EB-DNA檢測(cè)均陽性；另選門診體檢EB-IgG陽性（EB-VCA-IgG、EB-NA-IgG）而EB-IgM陰性的40例兒童為B組，門診體檢EB-IgG和EB-IgM均陰性的40例兒童為C組。3組對(duì)象性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過（編號(hào)：LCKY2019-90），所有患兒家屬知情同意。

表1 3組對(duì)象一般資料比較

1.2 血清收集 采集A組患兒入院時(shí)（急性期）及治療1周后（恢復(fù)期）以及B、C組兒童體檢時(shí)靜脈血3ml，加入含肝素溶液（10～50U/ml血樣本）的試管并混勻，使之呈不凝狀態(tài)。使用PBS將抗凝血稀釋1倍，18～20℃用水平離心機(jī)以400r/min離心30～40min，留取上層血清備用。

1.3 單核細(xì)胞中SIGIRR表達(dá)水平檢測(cè) 采用ELISA法。取血清2ml加等量PBS混勻，加入含有2ml淋巴細(xì)胞分離液的培養(yǎng)管中，然后再400r/s離心40min后出現(xiàn)分層，用200μl規(guī)格移液槍收集淋巴細(xì)胞，加入3～5ml PBS，300r/s離心 10min，去上清液加入 3～5ml PBS，200r/s離心 20min，去上清液加入 3～5ml PBS，400r/s離心10min，去上清液后得到單核淋巴細(xì)胞。ELISA試劑盒（美國PeproTech公司）在室溫下放置30min，每孔加50μl單核細(xì)胞勻漿或標(biāo)準(zhǔn)樣品，留2孔作空白對(duì)照用；塑料薄膜覆蓋微孔板，孵育2h；洗板4次，反轉(zhuǎn)酶標(biāo)板，將洗滌液輕甩干；每孔加50μl抗SIGIRR抗體（英國Abcom公司），封板，孵育2h；洗板4次，反轉(zhuǎn)酶標(biāo)板，洗滌液輕甩干；每孔按順序滴入顯色劑A和B，遮光常溫孵育30min；滴進(jìn)終止反應(yīng)液100μl，酶標(biāo)儀在450nm處檢測(cè)各孔光密度值（OD）；以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品所測(cè)OD確定其表達(dá)水平。

1.4 AST、ALT水平檢測(cè) 使用德國西門子ADV2400全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清AST、ALT水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，組內(nèi)治療前后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。原發(fā)性感染患兒血清SIGIRR表達(dá)水平與ALT水平的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原發(fā)性感染患兒治療前后血清SIGIRR表達(dá)水平及ALT、AST水平比較 治療1周后，原發(fā)性感染患兒血清SIGIRR表達(dá)水平明顯升高，ALT水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而AST水平變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 原發(fā)性感染患兒治療前后血清SIGIRR表達(dá)水平及AST、ALT水平比較

2.2 3組對(duì)象血清SIGIRR表達(dá)水平的比較 A組入院時(shí)血清SIGIRR表達(dá)水平與B、C組（[0.149 4±0.005 8）、（0.145 7±0.008 7）pg/ml]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=64.39，P＜0.01），其中A組較B、C組均明顯升高（均P＜0.05），B組與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。A組治療1周后與B、C組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.33，P＞0.05）。

2.3 原發(fā)性感染患兒血清ALT水平與SIGIRR表達(dá)水平的相關(guān)性 原發(fā)性感染患兒入院時(shí)血清ALT水平與SIGIRR 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.806，P＜0.05），治療 1周后兩者未見相關(guān)性（r=0.106，P＞0.05），見圖 1。

3 討論

EB病毒屬4型皰疹病毒，是一種非嗜肝病毒。絕大部分原發(fā)性EB病毒感染可導(dǎo)致肝損傷，但EB病毒感染肝損傷的分子機(jī)制目前仍不明確。既往臨床研究提示EB病毒與HBV感染導(dǎo)致的肝損傷存在某種相似性，可能通過B淋巴細(xì)胞亞群協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)[6]。Zekri等[7]研究發(fā)現(xiàn)HCV感染伴EB病毒急性感染的患者肝損傷更為嚴(yán)重。另有研究顯示EB病毒感染后可誘發(fā)機(jī)體免疫相關(guān)因子增加，從而介導(dǎo)體內(nèi)各臟器的損害，其中以肝損傷較為明顯[8]。

圖1 原發(fā)性感染患兒血清ALT水平與SIGIRR表達(dá)水平的散點(diǎn)圖（a：入院時(shí)；b：治療 1周后）

SIGIRR于1999年在人體細(xì)胞中初次鑒定[9]。它是白介素1受體和Toll樣受體超家族的一個(gè)特殊成員[10-11]，其細(xì)胞外部分的免疫球蛋白（Ig）結(jié)構(gòu)域由單個(gè)Ig分子組成，有別于其他由3個(gè)Ig分子組成的成員。SIGIRR的主要功能是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抑制過度炎癥反應(yīng)，并在維持宿主免疫自穩(wěn)定機(jī)制中起著重要作用。SIGIRR通過抑制白介素1受體和Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)通路來降低NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而發(fā)揮其抑制炎癥反應(yīng)的作用，同時(shí)通過影響Akt/mTOR和JNK等關(guān)鍵信號(hào)分子的活性，在細(xì)胞存活和增生中發(fā)揮重要的生物調(diào)節(jié)作用。近年來的研究表明，SIGIRR參與許多炎癥反應(yīng)的過程，與機(jī)體病原體感染、自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)等有著密切聯(lián)系；可見，SIGIRR廣泛參與各種疾病的免疫調(diào)節(jié)過程，是一個(gè)重要的免疫制動(dòng)子[12]。但SIGIRR與EB病毒感染導(dǎo)致的機(jī)體損害是否存在相關(guān)性，目前尚未明確。筆者分析了美國基因表達(dá)公共數(shù)據(jù)庫中一組有關(guān)肝臟疾病的數(shù)據(jù)（GEO數(shù)據(jù)庫號(hào)：GSE54238），發(fā)現(xiàn)慢性HBV病毒感染患者肝組織SIGIRR表達(dá)水平與正常人無明顯差異，而肝硬化、肝癌患者肝組織SIGIRR表達(dá)水平均明顯下降。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A組患兒急性期血清SIGIRR表達(dá)水平較B、C組均明顯下降，且與恢復(fù)期比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療1周后，A組患兒血清SIGIRR表達(dá)水平及ALT水平變化明顯，提示經(jīng)治療后，EB病毒感染導(dǎo)致的肝損傷已得到有效控制，SIGIRR水平升高是肝損傷的保護(hù)因子。此外還發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性感染患兒入院時(shí)血清ALT水平與SIGIRR表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示SIGIRR在EB病毒感染導(dǎo)致的肝損傷中起著重要作用。AST多在慢性肝損傷時(shí)升高明顯，本研究結(jié)果顯示EB病毒感染急性期與恢復(fù)期AST比較差異不明顯。

綜上所述，本研究從炎癥反應(yīng)入手，將SIGIRR引入EB病毒感染導(dǎo)致肝損傷的研究中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EB病毒感染后體內(nèi)SIGIRR表達(dá)水平明顯降低，且與ALT水平變化呈負(fù)相關(guān)，提示SIGIRR可能參與EB病毒肝損傷的病理、生理過程；經(jīng)治療后，SIGIRR表達(dá)水平升高，而ALT水平明顯降低，提示SIGIRR是此類肝損傷的保護(hù)因子。這為EB病毒感染致肝損傷的治療提供了一個(gè)全新的靶點(diǎn)及理論依據(jù)。