李群 周重昌 裘世杰 葉棟 鄧紅霞 沈毅 沈志森

頭頸部腫瘤最常見(jiàn)的病理類型為鱗狀細(xì)胞癌[1]，其發(fā)生率和死亡率在全球范圍內(nèi)逐年升高[2]。由于頭頸鱗癌早期臨床癥狀不典型，大部分患者診斷時(shí)已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并成為進(jìn)展期惡性腫瘤。因此，尋找一種能早期篩查或診斷頭頸鱗癌的分子標(biāo)志物是提高患者遠(yuǎn)期生存的關(guān)鍵。內(nèi)皮特異性分子1（endothelial specific molecule 1，ESM1）屬于蛋白聚糖家族，在內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)。研究表明，ESM1能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，從而促進(jìn)新血管生成[3]。亦有研究表明，ESM1在腫瘤生長(zhǎng)、發(fā)育和血管形成中發(fā)揮著重要作用[4]。目前已有研究表明，ESM1表達(dá)會(huì)影響結(jié)直腸癌、胃癌、鼻咽癌、肝細(xì)胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移[5-8]。但關(guān)于ESM1在頭頸鱗癌中的作用尚未闡明。因此，本研究充分利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)探索ESM1在頭頸鱗癌中的臨床應(yīng)用價(jià)值，并結(jié)合患者生存數(shù)據(jù)分析ESM1表達(dá)對(duì)頭頸鱗癌患者預(yù)后的影響，同時(shí)探討ESM1在輔助診斷頭頸鱗癌中的價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 組織標(biāo)本收集 選取2017年5月至2018年6月在本院接受手術(shù)治療的頭頸鱗癌患者49例，均經(jīng)組織病理學(xué)確診，術(shù)前均未接受放化療。取49例頭頸鱗癌組織及癌旁正常組織，立即存入液氮，并及時(shí)轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 ESM1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) （1）RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄：應(yīng)用Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）提取49對(duì)頭頸鱗癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本的總RNA。應(yīng)用 Go－Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega公司）對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA。（2）RT-PCR：使用Roche公司 RT-PCR 儀（Light Cycler480），反應(yīng)體系由 2×SYBR Green熒光染料、DNA聚合酶、PCR緩沖液、上下游引物和模板cDNA構(gòu)成。以人GAPDH管家基因?yàn)閮?nèi)參基因，標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)cDNA的量。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性 30s，72℃退火 40s，72℃延伸 5min，循環(huán)42次。引物信息如下：ESM1正義5′-GGTGGACTGCCCTCAACACT-3′，反義 5′-AAGGTGCCGTAGGGACAGTCT-3′；GAPDH 正義 5′-GGGAAGGT-GAAGGTCGGAGT-3′，反義 5′-GGGGTCATTGATGGCAACA-3′[9]。每個(gè)樣本針對(duì)ESM1和GAPDH檢測(cè)均重復(fù)3次。樣本ESM1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量=2-（Ct樣本-Ct內(nèi)參）。

1.3 生物信息資源及分析 從腫瘤基因組計(jì)劃（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)下載111例頭頸鱗癌組織及12例對(duì)照組織的全基因組表達(dá)數(shù)據(jù)（HTSeq-FPKM level 3）。應(yīng)用R軟件limma模塊分析頭頸鱗癌中差異表達(dá)基因（差值≥2或＜-2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率＜0.05），最終確定差值最顯著的ESM1為研究目的基因。從基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析（GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn）下載 519例頭頸鱗癌組織及44例正常組織的ESM1表達(dá)、臨床分期及生存的數(shù)據(jù)，分析ESM1在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系[10]。

1.4 基因富集分析 根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)頭頸鱗癌樣本ESM1表達(dá)的中位數(shù)分為ESM1高、低表達(dá)組。應(yīng)用GSEA軟件分析ESM1參與頭頸鱗癌進(jìn)展的潛在信號(hào)通路。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。頭頸鱗癌組織與其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織ESM1表達(dá)水平比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；不同臨床分期患者頭頸鱗癌組織ESM1表達(dá)水平比較采用單因素方差分析。利用Kaplan-Meier法繪制ESM1高、低表達(dá)的頭頸鱗癌患者總生存期及無(wú)病生存期的生存曲線，采用log-rank法比較生存率。繪制ROC曲線分析ESM1表達(dá)檢測(cè)對(duì)頭頸鱗癌的診斷效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)頭頸鱗癌差異表達(dá)基因的情況 對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中111例頭頸鱗癌組織及12例對(duì)照組織的HTSeq-FPKM level 3全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，結(jié)果顯示頭頸鱗癌中有928個(gè)基因表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組織，1 304個(gè)基因表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組織，其中ESM1的表達(dá)差異最明顯，見(jiàn)圖1。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中頭頸鱗癌差異表達(dá)基因的火山圖

2.2 頭頸鱗癌組織與癌旁正常組織ESM1表達(dá)水平比較 對(duì)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)519例頭頸鱗癌組織與44例癌旁正常組織中的ESM1表達(dá)水平進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ESM1在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05），見(jiàn)圖2a。為進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果，筆者收集并檢測(cè)了49對(duì)頭頸鱗癌組織及其癌旁正常組織的ESM1表達(dá)水平，結(jié)果證實(shí)ESM1在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)水平明顯高于其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織（P＜0.05），見(jiàn)圖2b。

2.3 不同臨床分期患者頭頸鱗癌組織ESM1表達(dá)水平比較 對(duì)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)519例不同臨床分期患者頭頸鱗癌組織ESM1表達(dá)水平進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖 3。

2.4 ESM1高、低表達(dá)頭頸鱗癌患者總生存期和無(wú)病生存期比較 根據(jù)ESM1表達(dá)的中位數(shù)，將GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)頭頸鱗癌組織樣本分為ESM1高表達(dá)組256例與ESM1低表達(dá)組259例，繪制ESM1高、低表達(dá)頭頸鱗癌患者總生存期及無(wú)病生存期的生存曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ESM1高表達(dá)組無(wú)病生存期高于ESM1低表達(dá)組（P＜0.05），ESM1高、低表達(dá)組總生存期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖 4。

圖2 頭頸鱗癌組織與癌旁正常組織ESM1表達(dá)水平比較

圖3 不同臨床分期患者頭頸鱗癌組織ESM1表達(dá)水平比較

2.5 ESM1高表達(dá)在頭頸鱗癌中的基因富集分析 在明確ESM1與頭頸鱗癌預(yù)后有關(guān)后，進(jìn)一步分析ESM1促進(jìn)頭頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制。以KEGG參考基因集作為參考基因，對(duì)ESM1進(jìn)行GSEA分析，結(jié)果顯示ESM1高表達(dá)的頭頸鱗癌樣本主要富集在MAPK信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路等，提示ESM1可能通過(guò)上述信號(hào)通路參與頭頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展，見(jiàn)圖5（插頁(yè)）。

圖4 ESM1高、低表達(dá)頭頸鱗癌患者總生存期和無(wú)病生存期比較（a：總生存期；b：無(wú)病生存期）

圖5 ESM1高表達(dá)在頭頸鱗癌中的基因富集分析

2.6 ESM1表達(dá)檢測(cè)對(duì)頭頸鱗癌的診斷效能 49對(duì)頭頸鱗癌驗(yàn)證樣本中，ESM1表達(dá)檢測(cè)診斷頭頸鱗癌的AUC為0.96，靈敏度為0.918，特異度為0.939，見(jiàn)圖6。提示ESM1可成為輔助診斷頭頸鱗癌的分子標(biāo)志物。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是涉及多步驟、多基因的復(fù)雜過(guò)程。從基因水平研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中基因譜變化，能為腫瘤早期診斷、治療方案的確定及預(yù)后判斷提供幫助。隨著腫瘤分子機(jī)制研究的不斷深入，目前已證實(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞在上述變化過(guò)程中發(fā)生著功能和結(jié)構(gòu)的變化。血管內(nèi)皮細(xì)胞能被多種由腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子激活，形成癌栓；亦可被腫瘤細(xì)胞分泌的蛋白溶解酶破壞內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)利于轉(zhuǎn)移；腫瘤細(xì)胞侵入繼發(fā)器官后，腫瘤細(xì)胞為持續(xù)增殖而刺激周邊形成新生血管，最終形成轉(zhuǎn)移灶。因此，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中各組分進(jìn)行深入研究是了解腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制的重要研究方向。ESM1是在1996年由法國(guó)科學(xué)家首先從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cDNA基因庫(kù)中克隆而來(lái)[11]。它是大小約50kDa的可溶性蛋白多糖，其成熟多肽包含165個(gè)氨基酸，在第137位絲氨酸殘端共價(jià)連接單一硫酸皮膚素鏈[11-12]。隨后，ESM1又被證實(shí)為硫酸皮膚素蛋白多糖[13]。它主要在人肺內(nèi)皮細(xì)胞和腎內(nèi)皮細(xì)胞中少量表達(dá)，后發(fā)現(xiàn)在多種內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)[11，13-14]，特別是炎癥內(nèi)皮細(xì)胞。因此，ESM1被認(rèn)為在心血管、炎癥和內(nèi)皮功能障礙中發(fā)揮著作用。一項(xiàng)包含15項(xiàng)研究的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，血漿中ESM1表達(dá)水平與患者罹患高血壓、冠心病等重大心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[15]。此外，ESM1亦能與白細(xì)胞整合素（LFA-1）結(jié)合，阻止LFA-1與其特異性結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）相結(jié)合，從而影響炎癥部位對(duì)淋巴細(xì)胞的招募[16]。

圖6 頭頸鱗癌患者ESM1表達(dá)檢測(cè)診斷的ROC曲線

近期研究者們對(duì)ESM1在人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腎癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胃及腸癌等多種人類腫瘤中，ESM1表達(dá)水平均明顯上調(diào)[17]。亦有研究表明，ESM1表達(dá)是肺癌等多種惡性腫瘤預(yù)后不佳的重要分子標(biāo)志物之一[18-20]。本文對(duì)ESM1在頭頸鱗癌中的表達(dá)及臨床意義作一探討，以期為頭頸鱗癌的臨床診治提供新的方向。本研究通過(guò)分析公共數(shù)據(jù)庫(kù)中頭頸鱗癌全基因組表達(dá)數(shù)據(jù)，獲得差異表達(dá)基因2 234個(gè)，其中ESM1的表達(dá)差異最明顯。隨后在臨床收集的樣本中也證實(shí)了ESM1在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)水平明顯高于其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織。同時(shí)發(fā)現(xiàn)ESM1表達(dá)檢測(cè)診斷頭頸鱗癌的AUC為0.96，靈敏度為0.918，特異度為0.939。故筆者認(rèn)為ESM1表達(dá)檢測(cè)具有簡(jiǎn)便、靈敏度和特異度均較高的優(yōu)勢(shì)，是輔助診斷頭頸鱗癌較為理想的指標(biāo)。利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，不同臨床分期的頭頸鱗癌患者ESM1表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨后，根據(jù)ESM1表達(dá)的中位數(shù)將頭頸鱗癌患者分成ESM1高、低表達(dá)組，繪制生存曲線發(fā)現(xiàn)ESM1高表達(dá)組頭頸鱗癌患者無(wú)病生存期明顯高于低表達(dá)組，而兩組患者總生存期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。待明確ESM1與頭頸鱗癌預(yù)后有關(guān)后，進(jìn)一步分析ESM1促進(jìn)頭頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制，結(jié)果顯示ESM1高表達(dá)能激活多種腫瘤相關(guān)信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路等。

綜上所述，本研究證實(shí)頭頸鱗癌組織中ESM1表達(dá)水平明顯升高，ESM1表達(dá)可作為頭頸鱗癌的潛在分子診斷標(biāo)志物，且有助于預(yù)測(cè)頭頸鱗癌的預(yù)后。