江巧麗 朱佳杰 戴蕾 羅靈和 楊珠瑩

潰瘍性結(jié)腸炎是一種腸道疾病，病程較長，同時(shí)具有易復(fù)發(fā)甚至癌變等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及身心健康[1]。潰瘍性結(jié)腸炎所致的腸道炎性反應(yīng)環(huán)境，會導(dǎo)致活性氧及活性氮含量明顯增加進(jìn)而引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終加重病變嚴(yán)重程度[2]。傳統(tǒng)抗結(jié)腸炎藥物5-氨基水楊酸與新型生物制劑均可提高炎癥性腸病療效，但由于潰瘍性結(jié)腸炎病因尚未完全明確，治療效果尚不理想。奧沙拉秦鈉是當(dāng)前治療潰瘍性結(jié)腸炎常用的藥物，不僅效果較好，且不良反應(yīng)少，已在臨床推廣用，但關(guān)于其具體作用機(jī)制及通過調(diào)控哪些信號通路發(fā)揮作用均未明確[3]。有研究表明微小RNA-34a（microRNA-34a，miR-34a）表達(dá)水平降低可緩解肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷并發(fā)揮保護(hù)作用[4]。相關(guān)研究報(bào)道沉默信息調(diào)節(jié)因子 1（silent information regulator 1，SIRT1）是 miR-34a靶基因，人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中miR-34a表達(dá)水平上調(diào)并可通過下調(diào)靶基因SIRT1表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生[5]。由此猜測miR-34a/SIRT1途徑與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。因此，本研究通過建立潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型，探討奧沙拉秦鈉對潰瘍性結(jié)腸炎的治療效果及其與miR-34a/SIRT1軸在氧化應(yīng)激方面的可能作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性小鼠80只，體重20～30g，購自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SYXK（浙）2017-0023。所有小鼠在溫度21～26℃、濕度45%～56%環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)3周，每天光照12h，白晝交替。

1.2 主要試劑與儀器 奧沙拉秦鈉膠囊購自天津力生物制藥股份有限公司（批號：20160218，規(guī)格：0.25g）；Lipofectamine2000（批號：170618）與 Trizol試劑（批號：170521）均購自美國Invitrogen公司；陰性轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與pHLV-U6-ZsGreen-Puro載體均購自上海吉凱基因技術(shù)有限公司；miR-34a過表達(dá)載體混合溶液由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；2，4，6-三硝基苯磺酸 （TNBS）（批號：20161221）購自美國 Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄與 SYBRTMGreenERTMKit試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司；兔抗鼠SIRT1抗體（批號：8469）購自美國CST公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號：20170416）購自北京博爾西科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（批號：20170312）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）（批號：20170321）、髓過氧化物酶（MPO）（批號：20170411）、NO（批號：20170310）、一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）（批號：20170312）、谷胱甘肽-過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）（批號：20160413）試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司；IL-1β（批號：20160111）、IL-6（批號：20160216）、TNF-α（批號：20160213）、IL-8（批號：20160318）、ELISA 試劑盒均購自北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司；PBS緩沖液（批號：20170412）購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司。qRT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司；DS-U3型凝膠成像分析系統(tǒng)購自日本Nikon公司；Image-proplus 6.0分析軟件均購自美國Media Cybernetics公司；Eclipse CI型正置光學(xué)顯微鏡購自南京斯高譜儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型建立、給藥及分組 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5d后隨機(jī)選取10只小鼠為對照組，對其余70只小鼠采用TNBS法建立潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型，具體方法為小鼠禁食24h后分別注射40mg/kg戊巴比妥鈉，0.6ml TNBS溶于0.25ml乙醇溶液中，制作橡膠軟管插入小鼠肛門（深度為8cm），將上述混合液經(jīng)注射器注入橡膠軟管，將小鼠倒立30s后，平放使其自然恢復(fù)。參照楊強(qiáng)[6]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法，建立潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型。按照隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的70只小鼠分為模型組、（奧沙拉秦鈉）低、中、高劑量組、陰性轉(zhuǎn)染組、miR-34a過表達(dá)組和奧沙拉秦鈉高劑量+miR-34a過表達(dá)組（HG組）7組，每組10只。奧沙拉秦鈉膠囊研磨后用100目篩過濾，與蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為50mg/ml（低）、100mg/ml（中）、150mg/ml（高）混懸奧沙拉秦鈉藥液，置于4℃冰箱保存。低、中、高劑量組分別給予227.5、455.0、682.5mg/kg奧沙拉秦鈉藥液灌胃，灌胃體積均為4.55ml/kg，奧沙拉秦鈉劑量相當(dāng)于成人治療劑量1.5g/d、3.0g/d、4.5g/d的9.1倍[7]。陰性轉(zhuǎn)染組在小鼠尾部靜脈注射100μl陰性轉(zhuǎn)染質(zhì)粒；模型組與對照組均在小鼠尾部注射100μl PBS；miR-34a過表達(dá)組在小鼠尾部靜脈注射100μl miR-34a過表達(dá)載體混合溶液；HG組在小鼠尾部靜脈注射100μl miR-34a過表達(dá)載體混合溶液；均連續(xù)給藥10d。對照組、模型組、低、中、高劑量組5組觀察比較奧沙拉秦鈉對小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)和miR-34a、SIRT1 mRNA表達(dá)水平的影響；對照組、模型組、高劑量組、陰性轉(zhuǎn)染組、miR-34a過表達(dá)組、HG組6組小鼠觀察比較奧沙拉秦鈉對小鼠結(jié)腸組織氧化應(yīng)激水平、血清炎性因子表達(dá)水平和結(jié)腸組織中miR-34a、SIRT1表達(dá)水平的影響。

1.3.2 結(jié)腸組織病理變化觀測 根據(jù)小鼠日?；顒訁⒄障嚓P(guān)文獻(xiàn)[8]報(bào)道進(jìn)行疾病活動指數(shù)（DAI）評分評定。連續(xù)給藥10d后禁食1d，于第12天處死小鼠并剪開小鼠腹腔，沿結(jié)腸與遠(yuǎn)端回腸切取整個(gè)腸段，采用0.9%氯化鈉溶液沖洗，展開結(jié)腸組織并仔細(xì)觀察。切取病變結(jié)腸組織，約0.11g，常規(guī)固定后制備石蠟切片，采用HE染色觀察結(jié)腸組織病變，光鏡下觀察結(jié)腸組織學(xué)變化，按照組織學(xué)損傷程度進(jìn)行病理評分（HI）[9]。

1.3.3 結(jié)腸組織中miR-34a、SIRT1 mRNA表達(dá)水平檢測 采用qRT-PCR法。給藥處理12d后，頸部脫臼處死小鼠，采集對照組、模型組、低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸組織，液氮中研磨結(jié)腸組織，加入10μl Trizol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR法檢測小鼠結(jié)腸組織中miR-34a、SIRT1 mRNA 表達(dá)水平。反應(yīng)條件 ：95℃5min，95℃ 30s，60℃ 30s，72 ℃ 30s，共 40 個(gè)循環(huán)。miR-34a以U6為內(nèi)參基因，SIRT1以GAPDH為內(nèi)參基因，采用 2-ΔΔCt相對定量法計(jì)算 miR-34a、SIRT1 mRNA 的相對表達(dá)量。

1.3.4 結(jié)腸組織氧化應(yīng)激水平檢測 采用硝酸還原酶法。取各組小鼠凍存結(jié)腸組織，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD水平；硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物比色法檢測MDA水平；采用硝酸還原酶法檢測NO水平；采用髓過氧化物酶檢測MPO水平；按照iNOS檢測試劑盒檢測iNOS水平；采用酶促反應(yīng)計(jì)算GSH-Px水平。

1.3.5 血清炎性因子表達(dá)水平檢測 采用ELISA法。給藥處理12d時(shí)采用脫頸法處死小鼠，并采用心臟取血法采集小鼠血液樣本置于離心管內(nèi)，3 000r/min離心15min，取上血清置于-80℃超低溫冰箱保存，采用ELISA法檢測各組小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8表達(dá)水平。

1.3.6 結(jié)腸組織中SIRT1蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。取50mg小鼠結(jié)腸組織并加入蛋白裂解液提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳反應(yīng)分離蛋白，移至PDVF膜，脫脂奶粉封閉，2h后加入SIRT1一抗（稀釋比均為 1∶1 000），置于 4℃冰箱孵育過夜，次日加入二抗（稀釋比1∶10 000），ECL顯影后置于凝膠分析系統(tǒng)觀察蛋白條帶，采用Imageproplus6.0圖像分析系統(tǒng)分析蛋白條帶積分光密度值，SIRT1蛋白相對表達(dá)量=SIRT1蛋白條帶積分光密度值/GADPH條帶積分光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t或SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組小鼠結(jié)腸組織病理變化比較 與對照組小鼠相比，模型組小鼠結(jié)腸黏膜明顯充血、水腫且結(jié)腸長度縮短；與模型組小鼠相比，奧沙拉秦鈉低、中、高劑量組結(jié)腸外觀明顯改善，見圖1。HE染色顯示對照組小鼠結(jié)腸組織黏膜完整且腺體結(jié)構(gòu)均呈排列整齊，沒有出現(xiàn)明顯潰瘍現(xiàn)象；與對照組小鼠相比，模型組小鼠結(jié)腸黏膜出現(xiàn)缺損且腺體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)分離，同時(shí)出現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤；低劑量組與模型組相似，中劑量組小鼠結(jié)腸黏膜出現(xiàn)一定缺損及隱窩損傷，中性粒細(xì)胞浸潤明顯減少且可見部分腺體結(jié)構(gòu)；與模型組相比，高劑量組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)與腺體結(jié)構(gòu)均較為完整，僅見少量中心粒細(xì)胞浸潤，未見隱窩損傷，見圖2。與對照組相比，模型組、低、中、高劑量組小鼠DAI評分與HI評分均明顯升高（均P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量組小鼠DAI評分與HI評分均明顯降低（均P＜0.05）；與高劑量組相比，低、中劑量組小鼠DAI評分與HI評分均明顯升高（均P＜0.05），見表1。

表1 5組小鼠DAI、HI評分比較（分）

圖1 5組小鼠結(jié)腸外觀圖

圖2 5組小鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果比較（×200）

2.2 5 組小鼠結(jié)腸組織中miR-34a、SIRT1 mRNA表達(dá)水平的比較 與對照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中miR-34a表達(dá)水平明顯升高，SIRT1 mRNA表達(dá)水平明顯降低（均P＜0.05）；與模型組相比，奧沙拉秦鈉低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸組織中miR-34a表達(dá)水平均明顯降低，SIRT1 mRNA表達(dá)水平均明顯升高（均P＜0.05）；與高劑量組相比，低、中劑量組小鼠結(jié)腸組織中miR-34a表達(dá)水平均明顯升高，SIRT1 mRNA表達(dá)水平均明顯降低（均P＜0.05）。見表2。

表25組小鼠結(jié)腸組織中miR-34a、SIRT1mRNA表達(dá)水平的比較

2.3 6 組小鼠結(jié)腸組織氧化應(yīng)激水平的比較 與對照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織MDA、MPO、NO、iNOS水平均明顯升高，SOD、GSH-Px水平均明顯降低（均P＜0.05）；與模型組相比，高劑量組小鼠結(jié)腸組織MDA、MPO、NO、iNOS水平均明顯降低，SOD、GSH-Px水平均明顯升高（均P＜0.05）；與高劑量組相比，miR-34a過表達(dá)組與HG組小鼠結(jié)腸組織MDA、MPO、NO、iNOS水平均明顯升高，SOD、GSH-Px水平均明顯降低（均P＜0.05）；與陰性轉(zhuǎn)染組相比，miR-34a過表達(dá)組小鼠結(jié)腸組織MDA、MPO、NO、iNOS 水平均明顯升高，SOD、GSH-Px 水平均明顯降低（均P＜0.05）。見表3。

2.4 6組小鼠血清炎性因子表達(dá)水平的比較 與對照組相比，模型組小鼠 IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8 表達(dá)水平均明顯升高（均P＜0.05）；與模型組相比，高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8表達(dá)水平均明顯降低（均P＜0.05）；與高劑量組相比，miR-34a過表達(dá)組與HG組IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8表達(dá)水平均明顯升高（均P＜0.05）；與陰性轉(zhuǎn)染組相比，miR-34a過表達(dá)組 IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8表達(dá)水平均明顯升高（均P＜0.05）。見表4。

2.5 6組小鼠結(jié)腸組織中miR-34a、SIRT1 mRNA、蛋白表達(dá)水平的比較 與對照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中miR-34a表達(dá)水平明顯升高，SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低（均P＜0.05）；與模型組相比，高劑量組小鼠結(jié)腸組織中miR-34a表達(dá)水平均明顯降低，SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯升高（均P＜0.05）；與高劑量組相比，miR-34a過表達(dá)組與HG組小鼠結(jié)腸組織中miR-34a表達(dá)水平均明顯升高，SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低（均P＜0.05）；與陰性轉(zhuǎn)染組相比，miR-34a過表達(dá)組miR-34a表達(dá)水平均明顯升高，SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低（均P＜0.05），見圖 3、表 5。

表3 6組小鼠結(jié)腸組織氧化應(yīng)激水平的比較

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎病變部位位于直腸與結(jié)腸黏膜層，其病理學(xué)變化主要為炎癥、糜爛及潰瘍，患者臨床表現(xiàn)為腹瀉、腹痛及黏液膿血便等，隨著病情嚴(yán)重程度加重可能發(fā)展為結(jié)腸癌[10]。潰瘍性結(jié)腸炎病因尚未明確且臨床缺乏特異性治療方法，因而如何控制潰瘍性結(jié)腸炎進(jìn)展并減少患者復(fù)發(fā)率成為當(dāng)前研究難點(diǎn)。因此，積極尋找潰瘍性結(jié)腸炎治療藥物成為熱點(diǎn)研究問題。

表4 6組小鼠血清炎性因子表達(dá)水平的比較（pg/ml）

圖3 6組小鼠結(jié)腸組織中SIRT1蛋白電泳圖

表5 奧沙拉秦鈉對轉(zhuǎn)染小鼠結(jié)腸組織中miR-34a、SIRT1表達(dá)水平的影響

奧沙拉秦鈉可有效治療反復(fù)發(fā)作型潰瘍性結(jié)腸炎并可緩解患者臨床癥狀，其作用效果明顯優(yōu)于柳氮磺吡啶等藥物，同時(shí)患者胃腸道不良反應(yīng)發(fā)生率均明顯降低[11-12]。本研究通過建立潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型，采用HE染色法觀察奧沙拉秦鈉對小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響，結(jié)果顯示低、中、高劑量組DAI評分與HI評分均低于模型組并可有效改善結(jié)腸外觀充血水腫現(xiàn)象，說明奧沙拉秦鈉有助于減緩潰瘍性結(jié)腸炎小鼠病理癥狀并減輕腸道黏膜損傷，提示奧沙拉秦鈉可有效治療潰瘍性結(jié)腸炎，與臨床研究相似。miR-34a表達(dá)水平與氧化應(yīng)激損傷程度密切相關(guān)，隨著氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇miR-34a表達(dá)水平明顯升高并可加重機(jī)體氧化應(yīng)激損傷[13]。機(jī)體受到氧化應(yīng)激損傷時(shí)SIRT1蛋白可通過減少細(xì)胞凋亡進(jìn)而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激反應(yīng)功能[14]。研究發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障大鼠中miR-34a表達(dá)水平升高可抑制靶基因SIRT1表達(dá)并加重機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而促進(jìn)白內(nèi)障發(fā)生[15]。本研究結(jié)果顯示模型組小鼠結(jié)腸組織中miR-34a表達(dá)水平高于對照組，而SIRT1表達(dá)水平明顯降低，高劑量組小鼠結(jié)腸組織中miR-34a表達(dá)水平明顯降低，SIRT1表達(dá)水平明顯升高，說明miR-34a/SIRT1途徑參與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生過程，奧沙拉秦鈉干預(yù)后可能通過降低miR-34a表達(dá)水平并上調(diào)SIRT1表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用。提示奧沙拉秦鈉可有效治療潰瘍性結(jié)腸炎小鼠，其可能通過調(diào)控miR-34a/SIRT1途徑發(fā)揮作用。

潰瘍性結(jié)腸炎所致腸道炎癥損傷與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，活性氧自由基大量釋放或抗氧化系統(tǒng)功能減弱均可造成組織損傷，MDA含量越高預(yù)示潰瘍性結(jié)腸炎大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度及細(xì)胞氧化程度加重，MPO含量增加直接反映腸道炎性細(xì)胞浸潤及炎癥反應(yīng)程度并可作為評估腸道炎癥嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，同時(shí)腸道中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞均可產(chǎn)生誘導(dǎo)型iNOS進(jìn)而促使NO生成量增加，NO又可進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)并造成細(xì)胞出現(xiàn)不同程度損傷，同時(shí)抗氧化系統(tǒng)中SOD與GSH-Px均具有抗氧化及抑制潰瘍性結(jié)腸炎腸組織脂質(zhì)過氧化等重要作用[16-18]。本研究為了進(jìn)一步探究奧沙拉秦鈉是否通過調(diào)控miR-34a/SIRT1途徑發(fā)揮作用，同時(shí)奧沙拉秦鈉高劑量對潰瘍性結(jié)腸炎的治療效果最為明顯，因而本研究構(gòu)建miR-34a過表達(dá)載體并將其經(jīng)注射器注入奧沙拉秦鈉高劑量小鼠中，比較分析各組小鼠結(jié)腸組織氧化應(yīng)激水平，結(jié)果顯示模型組小鼠結(jié)腸組織MDA、MPO、NO、iNOS水平均明顯高于對照組，SOD、GSH-Px水平均明顯降低；高劑量組小鼠結(jié)腸組織MDA、MPO、NO、iNOS水平均明顯低于模型組、miR-34a過表達(dá)組、HG組，而SOD、GSH-Px水平均明顯升高，說明奧沙拉秦鈉可通過抑制miR-34a表達(dá)并上調(diào)SIRT1表達(dá)進(jìn)而促使SOD、GSH-Px活性升高并增強(qiáng)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠抗氧化系統(tǒng)。提示奧沙拉秦鈉可通過調(diào)控miR-34a/SIRT1途徑進(jìn)而抑制潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織氧化應(yīng)激反應(yīng)。潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸組織炎癥反應(yīng)加劇，其中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8等釋放量增加并可進(jìn)一步誘發(fā)周圍組織損傷[19-20]。本研究結(jié)果顯示模型組小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8水平均明顯高于對照組，高劑量組小鼠血清 IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8 水平均明顯低于模型組、miR-34a過表達(dá)組、HG組，說明奧沙拉秦鈉可降低潰瘍性結(jié)腸炎小鼠炎癥反應(yīng)，其可能通過抑制miR-34a表達(dá)并間接上調(diào)SIRT1表達(dá)發(fā)揮作用。同時(shí)本研究檢測各組小鼠結(jié)腸組織miR-34a、SIRT1表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠結(jié)腸組織中miR-34a表達(dá)水平高于對照組，SIRT1表達(dá)水平明顯降低；高劑量組miR-34a表達(dá)水平明顯低于模型組、miR-34a過表達(dá)組、HG組，而SIRT1表達(dá)水平均明顯升高，進(jìn)一步證實(shí)奧沙拉秦鈉可調(diào)控miR-34a/SIRT1途徑，提示奧沙拉秦鈉可通過調(diào)控miR-34a/SIRT1途徑進(jìn)而抑制潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道組織炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，本研究通過建立潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型并應(yīng)用奧沙拉秦鈉治療，初步證實(shí)奧沙拉秦鈉基于miR-34a/SIRT1軸治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制。進(jìn)一步研究奧沙拉秦鈉基于miR-34a/SIRT1軸治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用效點(diǎn)及其與其他信號通路的可能作用機(jī)制均具有重要意義。今后將從分子水平及藥代動力學(xué)角度分析奧沙拉秦鈉治療潰瘍性結(jié)腸炎的有效性。