盛安群 陳翠娥 孫媛媛 張希希 錢燕 朱融和 周愛華 王楸 馮建華

支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonarydysplasia，BPD）是胎齡＜32周早產(chǎn)兒最常見的并發(fā)癥，由高氧、感染、炎癥、機械通氣等多因素引起，易繼發(fā)肺炎、肺動脈高壓等并發(fā)癥，嚴重影響患兒生長發(fā)育及生存質(zhì)量[1-4]。近年來隨著早產(chǎn)兒救治成功率的不斷升高，BPD發(fā)病率逐年升高[5]。但治療BPD的措施仍十分有限，且療效欠佳。中性粒細胞誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）是中性粒細胞釋放到胞外的包含有游離DNA、組蛋白、髓過氧化物酶、中性粒細胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是區(qū)別于凋亡與壞死的另一種細胞死亡方式[6]。NETs是機體重要的免疫防御機制，但其過度釋放或清除不及時，NETs相關(guān)效應分子則會導致組織損傷、器官功能失調(diào)或衰竭。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在多種炎性肺疾?。ㄈ缒倚苑卫w維化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征、肺氣腫、輸血相關(guān)性急性肺損傷等）中，均伴有NETs高表達及清除減少[7-11]。本研究建立高氧致BPD新生鼠模型并檢測其血清及肺組織中NETs變化，以進一步探討NETs在BPD發(fā)病機制中的作用，同時采用肝素干預并分析其對NETs的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 取SD成年大鼠[體重180～200g，購自上海實驗動物中心 SCXK（滬）2012-0002]，以雌雄比 3∶1合籠交配，每日清晨對雌鼠行陰道分泌物涂片、鏡檢，發(fā)現(xiàn)精子細胞后分籠飼養(yǎng)直到自然生產(chǎn)；取自然生產(chǎn)的48只新生SD大鼠為實驗對象，體重6～7g。本實驗得到溫州醫(yī)科大學實驗動物中心的許可。

1.2 主要儀器和試劑 氧艙自動控制系統(tǒng)（溫州醫(yī)科大學機能實驗中心自制），測氧裝置（TRD-2E1500B，德國 Envite C-Wismar公司），控氧儀（24h HBO-2B，浙江建德梅城電化分析儀器廠），二氧化碳檢測儀（S80053，德國Envite C-Wismar公司），共聚焦顯微鏡（FV1000，日本OLYMPUS公司），熒光酶標儀（POLARstar OPTIMA，德國BMG公司）。定量PicoGreen dsDNA試劑盒（P7589，加拿大Invitrogen公司），抗組蛋白H3抗體（SC51716，美國Santa Cruz公司），抗髓過氧化物酶抗體（GB11224，武漢谷歌生物科技有限公司），肝素鈉注射液（G2016，江蘇千紅生化制藥股份有限公司）。

1.3 動物分組與處理 將新生鼠隨機分為空氣組、高氧組、肝素組（O2+肝素）、對照組（O2+0.9%氯化鈉溶液），每組12只。空氣組置于空氣中，其他3組置于氧濃度為90%的高氧箱7d建立BPD模型。肝素組于造模開始后，每天腹腔注射低劑量肝素（250U/kg）至造模結(jié)束；對照組每天腹腔注射約25μl 0.9%氯化鈉注射液。室溫控制在（25±2）℃，濕度維持在 50%，給予動物 12h光/暗交替的環(huán)境，保證飼料和水充足，每日開箱1h。分別在出生后第7、14天每組各取6只，水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速切開左頸部皮膚，分離出頸總動脈，采集血液標本，并置于含3.8%枸櫞酸三鈉的EP管中，離心后吸出血清，置于-80℃冰箱保存，用于血清游離DNA水平檢測。切開新生鼠胸前皮膚，鈍性分離皮下組織、肌肉，切斷肋骨，打開胸腔，暴露肺組織，結(jié)扎右側(cè)支氣管，4%多聚甲醛溶液灌注左肺并固定，置于4℃冰箱保存，用作肺組織形態(tài)學分析及共聚焦纖維成像。

1.4 血清中游離DNA水平檢測 采用熒光染色法。使用PicoGreen雙鏈DNA熒光定量測定試劑盒檢測血清中游離DNA水平。稀釋標準品儲液和樣品，每孔50μl加入到96孔板，加入PicoGreen熒光染料100μl，室溫避光2～5min，熒光酶標儀檢測熒光強度，根據(jù)標準曲線計算cf-DNA/NETs，即游離DNA水平。

1.5 NETs免疫熒光染色及觀察 取左肺組織，石蠟包埋，4μm切片，脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液提取抗原，0.1%Triton X-100滲透10min，封閉標本，抗瓜氨酸組蛋白H3（1∶100）、抗髓過氧化物酶抗體（1∶500）4℃孵育過夜，PBS清洗，二抗（1∶400）37 ℃孵育 1h。采用 4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）避光染色 5～10min、90%甘油封片，共聚焦顯微鏡成像并觀察切片熒光信號范圍。

1.6 肺組織形態(tài)學觀察 取左肺中葉，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，4～5μm切片，HE染色，觀察肺組織形態(tài)變化。在光鏡下攝片，計數(shù)肺泡輻射狀計數(shù)（RAC）[12]和平均內(nèi)襯間隔（MLI）[13]。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4組新生鼠血清中游離DNA水平比較 出生后第7、14天，高氧組、對照組新生鼠血清游離DNA水平明顯高于空氣組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；肝素組新生鼠血清游離DNA水平明顯低于高氧組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 4組新生鼠血清中游離DNA水平比較（ng/ml）

2.2 4組新生鼠肺組織熒光顯微鏡下NETs變化 出生后第7、14天新生鼠肺組織NETs免疫熒光染色觀察，與空氣組比較，高氧組和對照組肺組織組蛋白、髓過氧化物酶熒光信號范圍明顯增加，提示NETs數(shù)量增加，見圖1；這證實高氧暴露會增加肺組織損傷。肝素組與高氧組相比較，熒光信號范圍減少；與空氣組比較差異不明顯，提示肝素干預可以減輕肺組織NETs形成。

圖1 4組新生鼠肺組織熒光顯微鏡下NETs變化

2.3 4組新生鼠肺組織形態(tài)學比較 隨著鼠齡增加，空氣組新生鼠肺組織發(fā)育逐漸成熟，肺泡明顯增多；高氧組、對照組在第7天即可觀察到肺泡簡單化，即肺泡壁變薄，部分肺泡融合，第14天時肺發(fā)育依然受阻明顯，肺泡腔擴大，數(shù)目減少，結(jié)構(gòu)紊亂，提示肺組織發(fā)生了類似BPD的病理改變；肝素組肺泡發(fā)育受阻不明顯，見圖2。出生后第7、14天，與空氣組比較，高氧組、對照組新生鼠RAC明顯減少，MLI明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與高氧組比較，肝素組RAC明顯增加，MLI明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；肝素組與空氣組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 4組新生鼠肺組織RAC及MLI比較

圖2 4組新生鼠肺組織形態(tài)學觀察（HE染色，×100）

3 討論

BPD是極低出生體重兒常見的呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥，嚴重影響患兒的生存質(zhì)量[5]。BPD病因復雜，其中早產(chǎn)兒肺發(fā)育不完善是BPD的發(fā)病基礎(chǔ)，其他因素如高氧、機械通氣、感染、炎癥等均可加重BPD。中性粒細胞是人體固有免疫應答的重要細胞，在BPD發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用，中性粒細胞的聚集和激活是引起肺部毛細血管和肺泡損傷的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，高氧暴露后新生鼠肺組織中性粒細胞明顯增多，肺組織明顯受損；而通過減少或清除肺內(nèi)中性粒細胞后，肺組織受損情況可出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)[14]。

NETs是由德國科學家Brinkmann等[15]發(fā)現(xiàn)的，它是活化的中性粒細胞釋放到胞外的，包含DNA、組蛋白、髓過氧化物酶、中性粒細胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G等構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。它的形成是區(qū)別于凋亡和壞死的另一種細胞死亡方式，NETs介導的殺滅途徑是人體重要的天然免疫應答機制，組織中NETs的誘捕作用能使機體有效防御病原體感染，減少病原體向血液擴散。然而，如果機體局部出現(xiàn)高濃度NETs，即可誘導大量胞外組蛋白釋放，同時誘導內(nèi)皮細胞損傷、凝血功能障礙和炎癥反應，最終導致組織損傷、器官功能失調(diào)或衰竭。既往研究發(fā)現(xiàn)，多種炎癥性肺疾病，包括囊性肺纖維化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征等均伴有中性粒細胞及NETs高表達，且清除減少[10-11，16-19]。Saffarzadeh 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，NETs可直接導致肺上皮細胞和內(nèi)皮細胞死亡，其細胞毒性呈劑量依賴性；同時抗組蛋白抗體及髓過氧化物酶抑制劑可明顯改善NETs引起的細胞毒性。本研究檢測了高氧致新生鼠BPD模型血清及肺組織中NETs水平，結(jié)果顯示血清中游離DNA水平及肺組織NETs數(shù)量均明顯升高；這提示NETs過度表達介導了BPD發(fā)病，為BPD發(fā)病機制提供了新的理論依據(jù)。

肝素是一種酸性黏多糖，帶負電荷；組蛋白是真核生物細胞染色質(zhì)中的堿性蛋白質(zhì)，帶正電荷。肝素可直接結(jié)合組蛋白，并能有效減輕組蛋白介導的細胞毒性反應[21-22]。近期多項研究結(jié)果提示，肝素可與細胞外組蛋白結(jié)合，降低NETs的活性，從而削弱NETs介導的凝血作用和感染相關(guān)的血管功能障礙，減輕NETs的生物毒性反應[21]。非抗凝血肝素也可以與組蛋白結(jié)合，抑制組蛋白介導的細胞毒性，并可降低無菌性炎癥和膿毒癥小鼠模型的死亡率[23]。低分子肝素亦可阻止活化的中性粒細胞自噬誘導和NETs的形成[24]，對膿毒血癥所致的急性肺損傷具有良好的治療作用。本研究結(jié)果顯示，高氧暴露可導致新生鼠肺泡發(fā)育停滯，表現(xiàn)為RAC下降、MLI升高；而肝素干預后，肺泡發(fā)育停滯改善，RAC升高，MLI下降，同時NETs水平明顯下降。

綜上所述，NETs在BPD發(fā)病中發(fā)揮了重要作用，而肝素可通過中和胞外組蛋白、破壞NETs結(jié)構(gòu)來達到改善BPD的作用。本課題從全新的角度闡明了肝素在BPD治療中的作用，為其臨床應用轉(zhuǎn)化提供了一定的理論依據(jù)。