丁孺孺， 滕夢婷， 胡佳穎， 張 鵬

(江蘇師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 徐州 221116)

開發(fā)新型、高效、低毒的抗癌藥物，選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤細(xì)胞生長而不影響非癌組織是抗癌藥物研發(fā)中面臨的最大難題[1]。腫瘤分子靶向治療是根據(jù)導(dǎo)致癌癥的相關(guān)分子(蛋白質(zhì)分子或DNA片段)專門設(shè)計(jì)的藥物，這些藥物可以特異性地識別并殺死腫瘤細(xì)胞。與傳統(tǒng)化療藥物相比，靶向藥物對正常細(xì)胞或組織的毒副作用很小，是目前抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一[2]。

苯并咪唑(Benzimidazole)是一種含有兩個氮原子的苯并雜環(huán)化合物，最初是因?yàn)槠錇榫S生素B12的重要組成部分而被關(guān)注(見圖1)[3]。苯并咪唑類衍生物具有很多生物活性，其中包括殺菌[4-5]、抗病毒[6-7]、消炎[8-9]及鎮(zhèn)痛[10-11]等。目前苯并咪唑已經(jīng)在臨床有很多應(yīng)用，例如奧美拉唑作為質(zhì)子泵抑制劑治療十二指腸潰瘍和甲苯咪唑作為驅(qū)蟲劑能與寄生蟲腸細(xì)胞微管蛋白特異性結(jié)合干擾其細(xì)胞微管從而達(dá)到驅(qū)蟲的效果。一些苯并咪唑衍生物被證明能在體外及體內(nèi)選擇性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長和血管生成[12-13]。國內(nèi)外關(guān)于苯并咪唑類衍生物的合成及其抗腫瘤機(jī)制的研究越來越多，筆者在數(shù)據(jù)庫可搜到近5年的相關(guān)文獻(xiàn)146篇，并且每年呈現(xiàn)上升的趨勢，由此可以推測以苯并咪唑?yàn)楣羌芎铣傻难苌锟赡苁墙窈罂鼓[瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)方向之一。

1 拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是細(xì)胞核中與DNA轉(zhuǎn)錄、修復(fù)和染色質(zhì)組裝有關(guān)的酶。與正常細(xì)胞相比，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶在腫瘤細(xì)胞中穩(wěn)定地高水平表達(dá)。通過抑制其活性可以抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶成為腫瘤治療的一個重要靶點(diǎn)[14-15]。

圖1 苯并咪唑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

Gao等把吖啶和苯并咪唑結(jié)合在一起，合成了化合物8a-8q，由于吖啶可以插入DNA并結(jié)合到DNA鏈中相鄰的堿基對之間。因此，二者的連接可以增加化合物對DNA的親和性。 通過8a-8q的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)化合物8l對人慢性髓系白血病細(xì)胞K562和人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖有較好的抑制作用，其IC50分別為2.68 μmol/L和8.11 μmol/L，并且證明其具有結(jié)合DNA及抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I的作用。JC-1染色證明化合物8l可以降低K562細(xì)胞的線粒體膜電位。Western Blot結(jié)果分析表明，隨著化合物8l的濃度升高caspase-7，caspase-9，caspase-3和PARP(poly ADP-ribose polymerase)的切割體比例依次升高，說明化合物8l可能是通過線粒體途徑誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡[16]。Singh等合成了具有供電子(OCH3)或者吸電子基團(tuán)(F，Cl)的1位和3位取代的雙苯并咪唑，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苯環(huán)上引入具有吸電子性質(zhì)的鹵素基團(tuán)可以增強(qiáng)化合物與ctDNA的親和度。Singh通過實(shí)驗(yàn)證明有吸電子基團(tuán)(F，Cl)的 6a和6b比引入甲氧基等供電子基團(tuán)的衍生物顯示出對腫瘤細(xì)胞更大的毒性[17](圖2)。

圖2化合物8l，6a和6b結(jié)構(gòu)

2 PARP抑制劑

DNA一直處于損傷和修復(fù)的動態(tài)平衡中，當(dāng)DNA受到損傷之后，細(xì)胞就會啟動DNA損傷修復(fù)機(jī)制，通過轉(zhuǎn)錄某些修復(fù)蛋白進(jìn)行DNA修復(fù)，使細(xì)胞繼續(xù)存活，如果損傷部位無法修復(fù)便會啟動凋亡機(jī)制使細(xì)胞凋亡。PARP(Poly ADP-ribose polymerase)是細(xì)胞核內(nèi)的一種參與DNA檢測和修復(fù)的酶，當(dāng)DNA單鏈?zhǔn)艿綋p傷后，多聚(ADP-核糖)聚合酶和一些其他修復(fù)蛋白會被募集到損傷部位進(jìn)行DNA修復(fù)。通過抑制PARP可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的DNA無法正常修復(fù)而加速其死亡。PARP抑制劑最初被用于增強(qiáng)放療或者化療的作用，直到2005年研究人員發(fā)現(xiàn)，brca1和brca2基因突變的腫瘤患者對PARP抑制劑的敏感度提高了約1000倍，其原因是brca突變使腫瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)能力受限，從而增加了細(xì)胞毒性[18]。第一個被FDA批準(zhǔn)上市的PARP抑制劑是阿斯利康公司研發(fā)的Olaparib，用于治療brca突變的晚期卵巢癌。

Veliparib(ABT-888)是一種口服的PARP-1和PARP-2抑制劑，其作用是延遲化療或放療引起的DNA損傷修復(fù)[19]。另外Veliparib可能在DNA損傷部位產(chǎn)生穩(wěn)定的PARP-1/2復(fù)合物，這些復(fù)合物的產(chǎn)生增加了細(xì)胞的毒性。Donawho等通過實(shí)驗(yàn)證明Veliparib可以穿過血腦屏障，并且能在異種移植腫瘤模型中增強(qiáng)替莫唑胺、順鉑、環(huán)磷酰胺和放療的作用[20]。Penning等通過實(shí)驗(yàn)證明Veliparib對于PARP-1 和 PARP-2具有很好的抑制的效果(Ki=5 nmol/L)，而且對C41細(xì)胞的EC50(PARP活性抑制50%的有效濃度)為2 nmol/L[21]。2014年1月15日，雅培生命宣布Veliparib 與化療藥物卡鉑聯(lián)合進(jìn)行III期臨床試驗(yàn)，用于評價其治療早期三陰性乳腺癌的安全性和有效性(圖3)[22]。

圖3 Veliparib和化合物27的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

Chen課題組設(shè)計(jì)并合成一系列了4，5，6，7-四氫噻吩吡啶-2-基苯并咪唑羧酸酰胺類化合物，部分化合物能有效地抑制PARP的活性，其中化合物27號對PARP-1 和 PARP-2的IC50分別為18和42 nmol/L。同時，該化合物可以選擇性地抑制brca2突變的V-C8細(xì)胞增殖，其CC50為920 nmol/L[23]。

3 微管蛋白抑制劑

微管作為細(xì)胞骨架在維持細(xì)胞的形狀，細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和有絲分裂起著重要作用，它的主要組分是α和β 微管蛋白異二聚體[24]。紫杉醇作為常見的微管蛋白抑制劑，1992年被FDA批準(zhǔn)上市用于卵巢癌和乳腺癌的治療并顯示出非常好的效果，它可以加速微管蛋白的聚合并抑制其解聚，從而使腫瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25]。紫杉醇最初來源于瀕臨滅絕的植物紅豆杉，但是，該植物生長緩慢而且紫杉醇含量極少。嚴(yán)重制約了紫杉醇的使用。因此人工合成以微管蛋白為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物顯得尤為重要。

Ahmed研究組將苯并咪唑和羥吲哚結(jié)合起來合成了一批化合物，通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)化合物5c和5p可以有效抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖，其IC50為1.84 μmol/L和1.97 μmol/L，而且化合物5c和5p可以很好地抑制微管蛋白聚合，IC50分別為1.12 μmol/L和1.59 μmol/L。另外這兩個化合物對正常人胚胎腎細(xì)胞HEK-293和正常猴腎細(xì)胞Vero的毒性很低，顯示出很好的選擇性。用5c和5p處理MCF-7細(xì)胞后進(jìn)行的流式細(xì)胞檢測分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被阻滯在G2/M期。通過分子對接發(fā)現(xiàn)化合物可與微管蛋白相互作用并有效結(jié)合(圖4)[26]。Lakshma等后來對化合物5c和5p進(jìn)行了凋亡機(jī)制研究，結(jié)果表明5c和5p可以通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，并且激活caspase-9來介導(dǎo)人類乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡[27]。Wang合成一批苯并咪唑脲類衍生物，它們對人體腫瘤細(xì)胞系的IC50值在納摩爾范圍其中化合物6o的抗腫瘤活性最好。通過免疫熒光和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6o 的濃度超過100 nmol/L時，人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460細(xì)胞紡錘體的形成受到抑制，最終阻滯在G2/M期，計(jì)算機(jī)模擬顯示，β-微管蛋白的Glu71(71位谷氨酸殘基)和α-微管蛋白的Asp251(251 位天冬氨酸殘基)與化合物6o的苯并咪唑基團(tuán)形成兩個關(guān)鍵氫鍵，α-微管蛋白的Arg2(2 位精氨酸殘基)與化合物6o的脲基形成一個氫鍵；同時α-微管蛋白的Arg2(2 位精氨酸殘基)與6o的氰基能夠與形成另一個重要的氫鍵(圖5)[28]。這些研究顯示了苯并咪唑類化合物作為微管蛋白抑制劑有著非常好的發(fā)展前景，隨著研究的不斷深入，相信會有更多以微管蛋白為靶點(diǎn)的高效、低毒抗癌化合物應(yīng)用在臨床上。

圖4 化合物5c，5p和6o的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖5 化合物6o分子對接模式圖[27]

4 穩(wěn)定G-四鏈體DNA及抑制端粒酶活性

人體端粒由富含鳥嘌呤(G)的DNA重復(fù)序列組成, 該序列在一定的條件下可以形成G-四鏈體 DNA 的結(jié)構(gòu)。一些小分子化合物可以誘導(dǎo)該結(jié)構(gòu)的形成并使之穩(wěn)定, 通過抑制端粒酶的活性降低癌基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[29]。

Yadav等分別合成了一系列在C1上有芳環(huán)和在C3上帶有取代苯并咪唑部分的β-咔啉-苯并咪唑衍生物。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5a(3-(6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-1-(4-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚)在低劑量就可以穩(wěn)定G-四鏈體DNA并抑制端粒酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HeLa細(xì)胞在經(jīng)化合物5a(3 μmol/L)處理24 h后有17%的細(xì)胞發(fā)生凋亡，48 h后有50%被阻滯在G1期。分子對接實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5a對四鏈體DNA表現(xiàn)出高的穩(wěn)定性的原因是由于其-OCH3，-NH基團(tuán)可以與G-四鏈體DNA的dG3，dA7之間形成了氫鍵(圖6)[30]。以穩(wěn)定G-四鏈體DNA及抑制端粒酶活性為思路來設(shè)計(jì)合成抗癌藥物具有良好的發(fā)展前景，但苯并咪唑類化合物在這方面的應(yīng)用還很少，具有非常大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

5 CK2蛋白激酶抑制劑

蛋白激酶可以通過磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性，它在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著十分重要的作用。通過蛋白質(zhì)的逐級磷酸化，使信號逐級放大，進(jìn)而引起細(xì)胞反應(yīng)。蛋白激酶功能失常將導(dǎo)致細(xì)胞生長、分化、代謝等功能異常, 最終導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生[31]。所以，用蛋白激酶為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物成了研究的重點(diǎn)，目前已有多個針對蛋白激酶靶點(diǎn)的藥物上市。第一個上市的小分子蛋白激酶抑制劑是Imatinib(商品名為 Gleeve)，它被稱為腫瘤靶向治療的里程碑[32]。關(guān)于苯并咪唑類化合物作為激酶抑制劑的研究也有相關(guān)報道。

圖6化合物5a結(jié)構(gòu)式及其推測結(jié)合模式分子圖像分析[29]

CK2(Casein kinase Ⅱ)作為多底物蛋白激酶，有300多種作用底物，這些底物對細(xì)胞生理功能產(chǎn)生了重要的作用，其中包括細(xì)胞代謝和運(yùn)動、DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號的加工與轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的增殖和凋亡、RNA 加工和翻譯[33]。目前CK2抑制劑中研究最多的是4,5,6,7-四溴-1H-苯并三唑(TBBt，IC50為0.32 μmol/L)、4,5,6,7-四溴-1H-苯并咪唑(TBBi，IC50為1.3 μmol/L)及其衍生物(圖7)。Chojnacki等根據(jù)多數(shù)CK2抑制劑都含有羥基或羧基，于是合成了含有羥基或羧基取代的TBBi和TBBt衍生物。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)被疊氮基取代的TBBi衍生物(3和5)的Ki的范圍在2.34～3.28 μmol/L，被羧基取代的三唑環(huán)衍生物(7和10)的范圍在0.91～1.96 μmol/L。MTT結(jié)果顯示，TBBi及其衍生物2、3、5、9在50 μmol/L的濃度下能使人急性淋巴細(xì)胞白血病T淋巴細(xì)胞CCRF-CEM的生長率降到約6%，MCF-7的生長率降到約20%[34]。

圖7 TBBi衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

表1 本文所綜述化合物匯總

激酶抑制劑選擇性低，毒副作用大的問題給此類抗腫瘤藥物研發(fā)帶來巨大挑戰(zhàn)[37]。目前文獻(xiàn)報道的苯并咪唑類CK2抑制劑雖然對腫瘤細(xì)胞顯示出較好的作用，但缺乏對正常細(xì)胞毒性的測定，限制了對該類化合物抗腫瘤價值的評估，因此對于苯并咪唑類CK2抑制劑的研究工作還需要進(jìn)一步開展。

6 小結(jié)與展望

由于苯并咪唑具有優(yōu)良的雜環(huán)結(jié)構(gòu)，所以在藥物研發(fā)方面占有一席之地。研究表明，當(dāng)苯并咪唑被脂族、芳族或雜環(huán)部分修飾之后可明顯提高其抗腫瘤活性。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)苯并咪唑類化合物對于拓?fù)洚悩?gòu)酶、端粒酶、微管蛋白、去乙?；浮ARP 等腫瘤藥物靶點(diǎn)等多方面應(yīng)用，因此，以苯并咪唑?yàn)楣羌苎邪l(fā)藥效更高、毒副作用更小、成藥性更強(qiáng)的化合物是今后抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)方向之一(表1)。筆者所在課題組根據(jù)文獻(xiàn)報道設(shè)計(jì)并合成一系列苯并咪唑類衍生物，并對其抗腫瘤活性做了較為深入的研究，目前已經(jīng)篩選出幾種低劑量下對于人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞A549、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231等細(xì)胞系抑制效果較好的苯并咪唑類衍生物。其中，化合物BZ-18 可以有效地抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移，BZ-25對三陰性乳腺癌MDA-MB-231、HCC1937和BT-483的IC50低于1 μmol/L，遠(yuǎn)低于人正常細(xì)胞(5 μmol/L)，表現(xiàn)出較好的選擇性。目前，實(shí)驗(yàn)室正在開展對化合物BZ-25作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制的研究。雖然近年來關(guān)于苯并咪唑衍生物合成和抗腫瘤作用研究很多，但多數(shù)研究者將注意力集中在如何增加其抗腫瘤活性，沒有對藥物的選擇性給予足夠的重視。如何針對該類藥物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)減小它們對人體正常細(xì)胞的毒性將是該類藥物分子設(shè)計(jì)的發(fā)展方向。例如，針對發(fā)生DNA損傷修復(fù)能力發(fā)生突變的腫瘤細(xì)胞可以設(shè)計(jì)出效果更好的PARP抑制劑，將會對這類腫瘤產(chǎn)生非常好的選擇性殺傷作用。另外由于苯并咪唑類化合物的優(yōu)良雜環(huán)結(jié)構(gòu)，可以針對能夠產(chǎn)生協(xié)同作用的多條信號通路設(shè)計(jì)出多靶點(diǎn)化合物，這樣將會產(chǎn)生更好的效果和更高的選擇性。總之，苯并咪唑類化合物在新藥設(shè)計(jì)方面具有極大的潛力，相信在不久的將來會有更多高效低毒并且價格惠民的治療癌癥的該類新藥出現(xiàn)在市場上。