裴久文， 方 勇， 高學(xué)志， 謝國(guó)排， 房 偉， 方澤民

(1. 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 合肥 230601； 2. 現(xiàn)代生物制造安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 合肥 230601；3. 安徽省微生物與生物催化工程研究中心， 合肥 230601； 4. 阜陽(yáng)市畜禽養(yǎng)殖服務(wù)中心， 阜陽(yáng) 236012)

飼料是養(yǎng)殖業(yè)的基礎(chǔ)支撐，也是動(dòng)物性食品安全的源頭。雖然我國(guó)飼料市場(chǎng)發(fā)展前景廣闊，但是蛋白飼料資源依然短缺，自給自足率不足50%，每年需從國(guó)外進(jìn)口大量豆粕、魚(yú)粉等以填補(bǔ)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的不足[1]。為了解決我國(guó)蛋白質(zhì)飼料資源不足的問(wèn)題，除了要充分開(kāi)發(fā)利用常規(guī)蛋白飼料資源，還要充分挖掘我國(guó)大量的非常規(guī)飼料資源，如酒糟、醋糟、醬渣、秸稈、工業(yè)廢棄物等[2]。而采用現(xiàn)代生物技術(shù)開(kāi)發(fā)利用非常規(guī)飼料資源，能夠使其中的抗?fàn)I養(yǎng)因子鈍化或脫毒，同時(shí)提高可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量，提升飼料的適口性和消化率[2]。

白酒糟渣是一類重要的非常規(guī)飼料資源，占全國(guó)年生產(chǎn)各類糟渣的70%以上。根據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局公布數(shù)據(jù)，2017年我國(guó)白酒產(chǎn)量約為1198萬(wàn)t，酒糟的年產(chǎn)約為3594萬(wàn)t。由于白酒糟酸度高、水分高，量大而集中，如不及時(shí)加以處理，極易腐敗變質(zhì)，造成環(huán)境污染。目前，國(guó)內(nèi)白酒產(chǎn)業(yè)對(duì)白酒糟最為普遍的處理方式是作為飼料行業(yè)的原料或基質(zhì)，一般經(jīng)干燥脫水甚至直接打包出售，附加值較低。

近年來(lái)，將白酒糟作為發(fā)酵基質(zhì)，通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料是酒糟飼料化的研究熱點(diǎn)，也是實(shí)現(xiàn)糟渣再利用的經(jīng)濟(jì)可行的方法之一[3]。然而，在現(xiàn)有工藝中，酒糟木質(zhì)素未能得到有效降解。白酒糟中的木質(zhì)素約占13%～18%，主要來(lái)自于發(fā)酵過(guò)程中添加的稻谷殼(約占干酒糟的40%～50%)[4-5]。由于木質(zhì)素不能被瘤胃微生物所分解，限制了反芻動(dòng)物對(duì)酒糟類飼料的高效利用。因此，木質(zhì)素使酒糟飼料的消化率及飼用價(jià)值降低，成為飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子。在酒糟高蛋白飼料生產(chǎn)中，添加木質(zhì)素降解菌，降解其中的抗?fàn)I養(yǎng)因子——木質(zhì)素，使與木質(zhì)素交聯(lián)的細(xì)胞壁多糖游離出來(lái)，同時(shí)釋放細(xì)胞壁內(nèi)可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是提高酒糟飼料利用效率的有效途徑。

自然界中，白腐真菌(White-rot fungi)是已知的能夠有效降解木質(zhì)素的一類真菌，能通過(guò)分泌木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(LiP)、錳過(guò)氧化物酶(MnP)和漆酶(laccase)等木質(zhì)素降解酶，在分子氧的參與下，依靠自身形成的H2O2，觸發(fā)一系列自由基反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)木質(zhì)素?zé)o特異性的氧化分解[6-8]。已有研究報(bào)道，白腐真菌應(yīng)用于生物降解秸稈木質(zhì)素以協(xié)同發(fā)酵生產(chǎn)飼料，包括Pleurotusostreatus[9-10]，Lentinulaedodes[11-12]，Phanerochaetechrysosporium[13]等。以白酒糟為基質(zhì)，目前僅有白腐真菌Phanerochaetechrysosporium被用以降解白酒糟木質(zhì)素[4]。Ganodermasp.真菌是自然界木質(zhì)素的有效分解者，可表達(dá)多種木質(zhì)素降解相關(guān)酶[14]，在木質(zhì)素降解方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究采用Ganodermasp. X1固態(tài)發(fā)酵白酒糟，優(yōu)化降解條件，以高效降解酒糟中的木質(zhì)素，提高粗蛋白的含量。

1 材料與方法

1.1 材料

Ganodermasp. X1為本實(shí)驗(yàn)室從枯木中分離篩選到的一株漆酶高產(chǎn)菌株。白酒糟由安徽金種子酒業(yè)股份有限公司提供，主要成分為高粱、稻殼。

YMG培養(yǎng)基(1 L)：葡萄糖4 g，酵母提取物4 g，麥芽提取物10 g，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1Ganodermasp. X1生長(zhǎng)最適pH值

配制YMG平板，滅菌前配制含200 mL YMG的培養(yǎng)液的500 mL三角瓶，調(diào)節(jié)液態(tài)YMG的pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，待溫度適中，倒平板。在同一個(gè)培養(yǎng)平板上取1 cm2左右的菌塊，接種至不同pH值平板上，每個(gè)pH值梯度3個(gè)重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 d，每天記錄菌絲生長(zhǎng)直徑。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基制備

從工廠取得新鮮酒糟，85 ℃恒溫烘干至恒重，稱取(10±0.05)g干酒糟至100 mL三角瓶中，按照固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用pH 6.5磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值及含水量，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻后備用。

1.2.3Ganodermasp. X1酒糟固態(tài)發(fā)酵

明確Ganodermasp. X1最適生長(zhǎng)pH值后，采用L9(33)正交試驗(yàn)(表1)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，一共9組，每組3個(gè)重復(fù)。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行接種，恒溫箱靜置培養(yǎng)。

表1 固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4 發(fā)酵后成分檢測(cè)

酒糟固態(tài)發(fā)酵后，發(fā)酵產(chǎn)物烘干稱重，檢測(cè)粗蛋白、纖維素、木質(zhì)素的含量，參照參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》[15]。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物選擇性指數(shù)分析

發(fā)酵后，以木質(zhì)素和纖維素失重的比值(選擇性指數(shù)，SF)作為依據(jù)，進(jìn)行木質(zhì)素降解最適條件的分析[16]，SF值越大，表明降解木質(zhì)素保留纖維素效果越好。

采用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并結(jié)合Duncan法進(jìn)行多重比較顯著性差異分析。

1.2.6 麩皮添加對(duì)酒糟發(fā)酵的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基的干重為10 g，其中酒糟與麩皮的比例分別為8∶2～3∶7，加入烘干的100 mL三角瓶中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵條件為培養(yǎng)基含水量75%，溫度28 ℃，接種量10%，發(fā)酵產(chǎn)物的檢測(cè)方法同1.2.4和1.2.5。

1.2.7 飼料感官性質(zhì)分析

根據(jù)《青貯飼料質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》評(píng)判飼料感官性質(zhì)[17]，包括發(fā)酵產(chǎn)物的氣味、手感、顏色和有無(wú)變質(zhì)等感官指標(biāo)，劣等品質(zhì)，腐爛的氣味，色澤是黑褐色，質(zhì)地粘結(jié)成塊；一般品質(zhì)，刺鼻酒酸味，暗褐色，質(zhì)地略帶黏性；良好品質(zhì)，淡酸味，褐黃色，質(zhì)地不粘手；優(yōu)等品質(zhì)，甘酸香味，聞著舒適，亮黃色，質(zhì)地松散軟弱，不粘手。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ganoderma sp. X1最適生長(zhǎng)pH值

從生長(zhǎng)趨勢(shì)可知，培養(yǎng)基pH 6時(shí)，Ganodermasp. X1生長(zhǎng)速度最快(圖1)。許多白腐真菌偏好在pH 4.0～5.0的微酸性的環(huán)境下生長(zhǎng)[18]，但也存在pH 7.0～9.0生長(zhǎng)的白腐真菌[19]。因此，不同菌種適宜的生長(zhǎng)環(huán)境不盡相同。固體培養(yǎng)基在滅菌的過(guò)程中pH會(huì)降低0.5～1.0，因此選擇pH 6.5的緩沖液調(diào)節(jié)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基pH值。

圖1 Ganoderma sp. X1生長(zhǎng)最適pH值

2.2 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物成分測(cè)定

測(cè)定固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物基本成分含量可知，木質(zhì)素含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，表明Ganodermasp. X1可以有效降解木質(zhì)素，其中第7組木質(zhì)素降解率最高，達(dá)到47.10%(圖2-a)。纖維素的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而減少(圖2-b)，表明Ganodermasp. X1可以有效降解纖維素，其中第4組纖維素降解最高，達(dá)到29.81%，而第7組纖維素降解最低，達(dá)到13.55%，說(shuō)明第7組發(fā)酵條件能夠很好地保存纖維素，減少營(yíng)養(yǎng)成分的損失。粗蛋白的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加(圖2-c)，其中第7組發(fā)酵15天的增加量最高，達(dá)到1.34 g，粗蛋白含量增加至17.30%。

2.3 選擇性指數(shù)分析

酒糟的微生物固態(tài)發(fā)酵一方面要求高效降解木質(zhì)素，另一方面要求能夠盡可能保存其中纖維素，即選擇性指數(shù)(SF)高[16]。因此，對(duì)發(fā)酵15 d的酒糟產(chǎn)物的SF值進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，不同發(fā)酵條件下木質(zhì)素降解和纖維素的消耗存在很大差異。由表3可知，第7組發(fā)酵條件獲得的發(fā)酵產(chǎn)物的SF值最高，是較優(yōu)的發(fā)酵條件。通過(guò)單因素不同水平的比較，可知采用含水量75%的固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)，以10%接種量，28 ℃培養(yǎng)15 d，木質(zhì)素降解率均最高。

a木質(zhì)素Lignin;b纖維素Cellulose;c粗蛋白Crude protein

圖2固態(tài)發(fā)酵后不同時(shí)間的產(chǎn)物成分含量
Figure 2 The fermented products in distiller grains after fermentation different time

表3 SF的測(cè)定結(jié)果

注：SF是木質(zhì)素/纖維素的比值，SF值越大，表明降解木質(zhì)素保留纖維素效果越好

2.4 顯著性分析

對(duì)木質(zhì)素的降解率的影響因素進(jìn)行極差法分析(表4)。在接種量、含水量和溫度單因素影響下，SF值的極差值R分別為0.71、0.56和0.99，即三因素對(duì)木質(zhì)素降解的影響程度為溫度>接種量>含水量。然而，接種量、含水量和溫度對(duì)SF值影響差異不顯著(P>0.05)。通過(guò)單因素不同水平比較，10%接種量、75%含水量、28 ℃為較好的發(fā)酵條件，得出第7組是最優(yōu)的發(fā)酵條件。

2.5 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基酒糟與麩皮配比優(yōu)化

2.5.1 發(fā)酵產(chǎn)物木質(zhì)素、纖維素及粗蛋白含量測(cè)定

采用酒糟與麩皮5∶5配比的固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)，發(fā)酵10 d，木質(zhì)素的降解率最高，達(dá)到46.36%(圖3-a)，纖維素的降解率最大，達(dá)到50.52%(圖3-b)。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，粗蛋白含量呈增加的趨勢(shì)(圖3-c)。采用酒糟與麩皮5∶5比例的固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)，粗蛋白含量增加最快，發(fā)酵10 d達(dá)到最高，從初始的1.39 g增加到1.64 g，粗蛋白含量增加至24.80%，較僅以酒糟為培養(yǎng)基質(zhì)的發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量(17.30%)有較大提升。因此，以酒糟與麩皮為培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，能夠有效的提高粗蛋白的含量，同時(shí)縮短發(fā)酵時(shí)間。

表4 選擇性指數(shù)顯著性分析

注：同一列據(jù)肩標(biāo)含不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)

2.5.2 不同培養(yǎng)基配比發(fā)酵產(chǎn)物SF值分析

固態(tài)發(fā)酵10 d后，由表5中SF值可以看出酒糟和麩皮3∶7的SF值最高，其次是5∶5的比例。說(shuō)明Ganodermasp. X1在這兩個(gè)比例中有較好的木質(zhì)素降解能力。但5∶5的比例木質(zhì)素有最高降解率，而且粗蛋白的含量增加最高，因此選擇酒糟與麩皮5∶5的配比作為最適的發(fā)酵培養(yǎng)基。

a木質(zhì)素Lignin;b纖維素Cellulose;c粗蛋白Crude protein

圖3酒糟與麩皮配比優(yōu)化后的發(fā)酵產(chǎn)物成分含量

Figure 3 The fermented producs in the distiller grains after optinization of the ratio of distiller grains and to wheat bran

表5 SF的測(cè)定結(jié)果

1、4：發(fā)酵前；2、5：發(fā)酵5 d；3、6：發(fā)酵10 d

圖4發(fā)酵前后酒糟的形態(tài)

Figure 4 Changes in the state of the distillers grains

2.6 發(fā)酵前后酒糟感官評(píng)價(jià)

發(fā)酵前后固態(tài)培養(yǎng)基形態(tài)參考《青貯飼料質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》評(píng)價(jià)，原始狀態(tài)的干酒糟有刺鼻酒酸味，色澤為黑褐色，質(zhì)地粘結(jié)成塊，為一般品質(zhì)(圖4)。當(dāng)發(fā)酵至第5天時(shí)，培養(yǎng)基中菌絲大量生長(zhǎng)，淡酸味、褐黃色、略帶黏性，為較好品質(zhì)；發(fā)酵至第10天時(shí)，菌絲聚集形成厚厚的菌質(zhì)體，打開(kāi)紗布，會(huì)聞到淡淡的清香味，酒糟呈亮黃色，質(zhì)地松軟，為良好品質(zhì)。這說(shuō)明當(dāng)酒糟與麩皮的比例適當(dāng)，會(huì)加快菌絲的生長(zhǎng)，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生菌質(zhì)體，改善酒糟的品質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

靈芝是一類重要的白腐真菌，其對(duì)木質(zhì)素的利用強(qiáng)于對(duì)纖維素和半纖維素的利用。靈芝可胞外分泌多種木質(zhì)素分解酶，包括LiP、MnP和laccase，將木質(zhì)素等分解為小分子的單糖或雙糖[20]。另一方面，靈芝能夠分泌淀粉酶、蛋白酶、以及纖維素分解酶等其他酶系，這些酶可能在靈芝降解木質(zhì)素過(guò)程中直接或間接地發(fā)揮作用[21]。以靈芝為發(fā)酵菌株，固態(tài)發(fā)酵玉米秸稈、稻草等農(nóng)業(yè)廢棄物，降解其中木質(zhì)素，是此類資源利用的有效途徑。孫芹英等[22]用靈芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶及對(duì)秸稈木質(zhì)素的降解中，在發(fā)酵30 d時(shí),玉米秸稈的木質(zhì)素降解率最大，達(dá)到23.7%，油菜秸稈也達(dá)到了16.2%。Shrivastava等[23]用靈芝固態(tài)發(fā)酵秸稈制備反芻動(dòng)物飼料，在發(fā)酵15 d后，酸性洗滌纖維素含量、中性洗滌纖維素含量和半纖維素的含量分別降至24.77%，31.03%和42.51%，且秸稈木質(zhì)素含量降低34.95%。

本研究中，采用具有Ganodermasp. X1固態(tài)發(fā)酵白酒糟，降解酒糟中的木質(zhì)素，發(fā)酵15 d木質(zhì)素的降解率可達(dá)47.10%，且粗蛋白達(dá)到17.30%。由此推測(cè)，Ganodermasp. X1可能分泌木質(zhì)素降解相關(guān)酶，部分分解酒糟中的木質(zhì)素，其降解周期及效率高于黃孢原毛平革菌對(duì)白酒糟木質(zhì)素的降解[24]。另一方面，靈芝菌體生物活性成分多樣，含有多糖類、萜類、生物堿類、氨基酸蛋白質(zhì)類等多種成分[25]。因此Ganodermasp. X1發(fā)酵白酒糟后能夠有效提升發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量，并且菌種在代謝過(guò)程中可能產(chǎn)生多種活性成分,豐富發(fā)酵飼料的營(yíng)養(yǎng)。

麩皮是一類重要的農(nóng)副產(chǎn)品，其可有效地誘導(dǎo)白腐真菌中相關(guān)木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生[25]。將麩皮與酒糟配比后作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，發(fā)酵10 d，木質(zhì)素降解率可達(dá)46.36%，且粗蛋白含量提升至24.80%。因此采用麩皮白酒糟混合基質(zhì)發(fā)酵，能夠更有效地促進(jìn)Ganodermasp. X1對(duì)木質(zhì)素的降解，并提升粗蛋白含量，同時(shí)縮短了發(fā)酵時(shí)間。

以上研究表明Ganodermasp. X1固態(tài)發(fā)酵白酒糟能有效地提高酒糟的品質(zhì)，一方面有效降解酒糟中木質(zhì)素并保存纖維素；另一方面可有效提高粗蛋白的含量，有效保存營(yíng)養(yǎng)，因此在降解酒糟木質(zhì)素制備高品質(zhì)粗飼料方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。