秦緒慧, 馬立群, 歐陽聰, 王海霞, 浦易之, 薛 璐

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物研究所 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430074)

胎盤特異蛋白8 (Placenta special gene 8，PLAC8)又稱onzin或C15，是一種高度保守并富含半胱氨酸，有著獨(dú)特結(jié)構(gòu)并在組織中特異性表達(dá)的蛋白。PLAC8首次發(fā)現(xiàn)是在人樹突狀細(xì)胞中，定位于染色體的4q13-4q21區(qū)域。PLAC8含有5個(gè)外顯子，mRNA全長(zhǎng)829 bp，編碼115個(gè)氨基酸，蛋白分子質(zhì)量為12.4 ku[1-2]。廣泛分布于真核生物中的PLAC8不含信號(hào)肽，但是在一些哺乳動(dòng)物中有類似限制酶位點(diǎn)的信號(hào)肽。PLAC8在不同物種中氨基酸序列差異較大，說明在進(jìn)化早期，PLAC8的進(jìn)化并不穩(wěn)定[1,3]，也提示了PLAC8在不同物種中可能承擔(dān)著不同的功能角色。

PLAC8的表達(dá)調(diào)控涉及多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，與細(xì)胞的凋亡、增殖及分化等生理過程都有著十分密切的關(guān)系[1-2]。在細(xì)胞分化方面，有研究發(fā)現(xiàn)PLAC8是棕色脂肪細(xì)胞分化所必需的蛋白，如果PLAC8蛋白缺失可能會(huì)導(dǎo)致寒冷耐受不良癥、遲發(fā)性肥胖和棕色脂肪細(xì)胞功能受損[4]。Jimenez-Preitner等發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)，PLAC8在棕色脂肪組織和白色脂肪組織中均有表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)PLAC8敲除小鼠會(huì)產(chǎn)生遲發(fā)性肥胖，棕色脂肪分化異常，產(chǎn)熱能力下降[5]。除此之外PLAC8也廣泛存在于免疫細(xì)胞之中，尤其是巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞。如果在成體上敲除該基因，雖然不會(huì)影響吞噬細(xì)胞的吞噬作用，但是其吞噬效率會(huì)降低，這提示我們PLAC8可能在免疫過程中發(fā)揮著十分重要的作用[2,6]。Ledford等發(fā)現(xiàn)，PLAC8基因敲除小鼠雖然發(fā)育的正常，但是在噬中性粒細(xì)胞的功能上表現(xiàn)出明顯的缺陷[7]。在調(diào)控細(xì)胞增殖方面，Zou[8]和Uehara[9]等用人胰腺細(xì)胞系體外實(shí)驗(yàn)證明，通過siRNA敲除PLAC8蛋白的表達(dá)能抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。在結(jié)腸癌的相關(guān)研究中，Li等在結(jié)腸癌細(xì)胞系中敲除內(nèi)源PLAC8后發(fā)現(xiàn)腫瘤的體積減小，這一過程可能是通過改變ERK2的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的[10]。與之相反的是，Zou等通過細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)研究證明，在肝癌細(xì)胞中，PLAC8下調(diào)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞存活，促使細(xì)胞增殖進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的形成[9]。由此可見，PLAC8蛋白在不同腫瘤來源細(xì)胞系中對(duì)增殖具有不同的調(diào)控模式，值得進(jìn)一步研究。

人胚胎腎細(xì)胞極少表達(dá)細(xì)胞外配體所需的內(nèi)生受體，且比較容易轉(zhuǎn)染，是一個(gè)十分常用的表達(dá)研究外源基因的工程細(xì)胞株。因此在本課題中，我們利用流式細(xì)胞術(shù)與CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)相結(jié)合的方法在293T細(xì)胞系上進(jìn)行PLAC8蛋白敲除的研究，最終獲得了PLAC8蛋白敲除人胚腎細(xì)胞系。隨后的一系列功能實(shí)驗(yàn)表明，敲除細(xì)胞系的增殖相比野生型有明顯的下降。進(jìn)一步地，我們發(fā)現(xiàn)PLAC8蛋白的表達(dá)下降同時(shí)伴隨著AKT，ERK2，RAF-1，C-MYC等基因的表達(dá)水平改變，提示在293T細(xì)胞中，PLAC8可能通過ERK/MAPK信號(hào)通路來調(diào)控細(xì)胞增殖。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人胚腎細(xì)胞株 (293T)購于武漢大學(xué)細(xì)胞庫，PX458質(zhì)粒、感受態(tài)細(xì)菌Stbl3、10×T4 Ligation Buffer、T4 連接酶購于武漢淼靈生物，T4 PNK、10×TaqBuffer、dNTP、rTaq酶購于TaKaRa，F(xiàn)ast Digest BpiI、Fast AP、10×Fast Digest Buffer、Protein Ladder購于Thermo Scientific，DTT購于Biosharp，Endo-free Plasmid Mini Kit購于Omega，AxyPrep DNA Gel Extraction Kit購于AxyGen，PBS購于HyClone，血清購于ScienCell，雙抗、胰酶、Lipofectamine 3000試劑購于Invitrogen, BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、PMSF、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、Tween-20、Beyo ECL Plus、上樣緩沖液購于碧云天公司，甲醇 (分析純)、氯化鈉、甘氨酸、磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉、氯化鈣購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，Anti-PLAC8抗體購于Cell Signaling Technology，Anti-β-Actin、HRP-goat anti mouse IgG、HRP-goat anti rabbit IgG購于康為世紀(jì)。引物合成、基因測(cè)序交由武漢擎科生物公司完成。

1.2 sgRNA寡核苷酸鏈序列及檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)

首先使用CRISPR在線sgRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站 (http://crispr.mit.edu/)，分別對(duì)PLAC8基因5個(gè)外顯子上的sgRNA的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。根據(jù)評(píng)分系統(tǒng)，選擇得分較高的靶點(diǎn)序列，分別在PLAC8的外顯子2和外顯子3上設(shè)計(jì)2個(gè)sgRNA (S1及S2)，見圖1。需要指出的是，若sgRNA的序列第一個(gè)堿基不是G，則需要在前面補(bǔ)一個(gè)G以取得更好的編輯效率。以該sgRNA序列為模板，設(shè)計(jì)其互補(bǔ)鏈，然后分別在sgRNA5′ 端添加CACCG，互補(bǔ)鏈5′ 端添加AAAC，3′ 端添加C，以此人工合成BpiI酶的酶切位點(diǎn)。sgRNA序列見表1。

為確定細(xì)胞是否被編輯，需要對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。因此我們使用軟件Primer Premier 5分別在兩個(gè)sgRNA潛在靶點(diǎn)的上下游200～300 bp處各設(shè)計(jì)了一對(duì)檢測(cè)引物 (PLAC8-AF/AR，PLAC8-DF/DR)，見圖1。引物序列見表2。

圖1 PLAC8基因結(jié)構(gòu)特征及sgRNA設(shè)計(jì)

1.3 PX458-sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

選擇PX458質(zhì)粒作為載體，首先將含有質(zhì)粒的保存菌液用LB液體培養(yǎng)基在37 ℃，180 r/min的搖床中培養(yǎng)14 ～ 16 h，用質(zhì)粒小提試劑盒提取PX458質(zhì)粒，測(cè)濃度，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

用Fast DigestBpiI酶切割質(zhì)粒PX458，使其線性化，然后用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳后用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)片段大小及線性化效率，然后進(jìn)行切膠回收，測(cè)濃度，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 PLAC8 sgRNA引物序列

表2 PLAC8 敲除細(xì)胞系檢測(cè)引物

將合成的sgRNA寡核苷酸單鏈梯度退火為雙鏈，用T4 DNA連接酶與線性化的PX458連接，然后轉(zhuǎn)化到stbl3感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性單克隆菌落，將菌液做菌落PCR，將帶有正確條帶的菌落送測(cè)序驗(yàn)證是否構(gòu)建成功。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

293T細(xì)胞培養(yǎng)在含5% CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染前24 h取對(duì)數(shù)期細(xì)胞以5×105/孔的細(xì)胞密度接種到6孔板中，細(xì)胞密度長(zhǎng)到70%～80%時(shí)開始做轉(zhuǎn)染。首先將細(xì)胞培養(yǎng)液換成不含血清的opti-MEM培養(yǎng)基饑餓30 min，然后將5 μL p3000試劑及2.5 μg的PX458-sgRNA重組質(zhì)粒先后加入125 μL的opti-MEM中。與其同時(shí)，將7 μL的lipo3000試劑加入到另一管125 μL的opti-MEM中，邊加邊混合，靜置5 min。然后將兩管轉(zhuǎn)染組分輕輕混合，再靜置20 min后加入到事先饑餓好的細(xì)胞中。5 h后，換上含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后觀察熒光。

1.5 流式細(xì)胞儀分選

將準(zhǔn)備分選的細(xì)胞用胰酶消化下來，1000 r/min離心5 min的條件下用PBS洗2次，然后取1 mL準(zhǔn)備好的含1%胎牛血清的PBS將細(xì)胞吹打混勻，把細(xì)胞過濾膜分散成單細(xì)胞，收集在滅菌的15 mL離心管中，上機(jī)前用1 mL槍頭輕輕混勻，準(zhǔn)備好上機(jī)分選。上機(jī)后選擇single模式，根據(jù)陰性對(duì)照調(diào)節(jié)電壓，設(shè)置陽性門后，將帶有綠色熒光的單個(gè)細(xì)胞打到事先加入200 μL含20%胎牛血清和2%雙抗的完全培養(yǎng)基的96孔板中。

1.6 單細(xì)胞培養(yǎng)

將篩選出來的細(xì)胞養(yǎng)在含有20%血清和2%抗生素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的96孔板中，約15 d便可以將細(xì)胞轉(zhuǎn)到24孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%就可以將細(xì)胞轉(zhuǎn)入12孔板中，最后將細(xì)胞轉(zhuǎn)到6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.7 測(cè)序檢測(cè)

收取6孔板中的細(xì)胞提取基因組，送至武漢擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序使用的引物為PLAC8-AF或PLAC8-DF。通過與野生型細(xì)胞基因組做比較，篩選出被編輯過的細(xì)胞，并將該細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存，以便進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

1.8 Western Blot檢測(cè)編輯效率及蛋白表達(dá)

提取被編輯細(xì)胞的蛋白質(zhì)，以野生型293T細(xì)胞為對(duì)照，檢測(cè)PLAC8及MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。根據(jù)待檢測(cè)蛋白分子量用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒配制10%～15%的分離膠和5%的濃縮膠。濃縮膠30 mA、80 V跑50 min，分離膠30 mA、100 V跑1.5 h。電泳完畢后，200 mA、100 V濕法轉(zhuǎn)膜1 h。 轉(zhuǎn)膜后，用5%的脫脂奶粉將轉(zhuǎn)好的膜封閉1 h，用TBST洗3次后，孵育一抗 (一抗稀釋比例為1∶1000)，4 ℃過夜。接著用TBST洗3次，每次10 min，室溫下敷二抗1 h (二抗稀釋比例為1∶10 000)，TBST洗3次，每次10 min，TBS洗2次，每次5 min，用ECL顯影，觀察結(jié)果。所有的Western Blot實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，并選取最具有代表性的結(jié)果進(jìn)行呈現(xiàn)。

1.9 MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)速度

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期被編輯的細(xì)胞系和野生型293T細(xì)胞，用PBS洗2次，用胰酶將細(xì)胞消化下來，1000 r/min離心5 min。加入1 mL 完全培養(yǎng)基將細(xì)胞吹散，置于含4 mL培養(yǎng)基的中皿里，混合均勻。取20 μL 細(xì)胞液置于1.5 mL 離心管中，再加入20 μL臺(tái)盼藍(lán)染液和60 μL PBS，用槍頭混合均勻。取10 μL滴在血球計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，重復(fù)3次，取平均數(shù)。

以2000個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞鋪在96孔板中，重復(fù)6個(gè)孔，鋪5個(gè)96孔板。一天測(cè)一個(gè)96孔板。細(xì)胞貼壁后，在有細(xì)胞的孔中加入20 μL 5 mg/mL的MTT試劑，不用換液。4 h后除去孔內(nèi)的完全培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO。在酶標(biāo)儀上震蕩10 min，490 nm檢測(cè)OD值，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除PLAC8基因的293T細(xì)胞株的構(gòu)建

為了成功構(gòu)建打靶載體，我們用T4 DNA連接酶將合成的sgRNA單核苷酸鏈退火連成雙鏈，然后與線性化的PX458連接，轉(zhuǎn)化到stbl3感受態(tài)中，37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，做菌落PCR后，將有正確條帶的菌液進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，sg-RNAS1、S2分別正確插入到PX458載體中。

接下來，我們用lipo3000轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的兩個(gè)打靶載體分別轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，48 h后汞燈觀察細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光，判斷轉(zhuǎn)染效率 (圖2)。由圖2可知，PX458-sgRNA-S1和PX458-sgRNA-S2這兩個(gè)質(zhì)粒都成功轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率約為80%。

A: PX458-sgRNA-S1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光視野 (100×)；b：PX458-sgRNA-S2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光視野(100×)；c：PX458-sgRNA-S1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的明場(chǎng)視野(100×)；d：PX458-sgRNA-S2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的明場(chǎng)視野 (100×)

圖2敲除PLAC8基因的293T細(xì)胞株的構(gòu)建

Figure 2 Construction ofPLAC8 knockout 293T cells a and c detection
of GFP via fluorescence microscopy after PX458-sgRNA-S1
transfection (green, PLAC8; 100×)

2.2 細(xì)胞株的鑒定

為了獲得單一編輯的細(xì)胞，在載體成功轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞后，利用流式細(xì)胞儀將轉(zhuǎn)染后帶有綠色熒光的細(xì)胞以每孔一個(gè)細(xì)胞的密度篩選至96孔板中培養(yǎng)，并通過基因組測(cè)序鑒定被編輯的細(xì)胞系。測(cè)序結(jié)果 (圖3-a)顯示，轉(zhuǎn)染sgRNA2篩選出來兩株細(xì)胞株基因組紅色方框處發(fā)生了編輯，并出現(xiàn)了明顯的套峰 (圖3-b)，分別命名為KD1和KD2。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該細(xì)胞是否成功編輯，使用錯(cuò)配酶T7E1進(jìn)行驗(yàn)證，以KD2細(xì)胞株為例，結(jié)果顯示其基因組能夠被錯(cuò)配酶酶切成178 bp和299 bp兩個(gè)小片段 (圖 3-c)。以上實(shí)驗(yàn)共同證明KD1、KD2細(xì)胞系的基因組已被成功編輯。

為了進(jìn)一步檢測(cè)KD1、KD2細(xì)胞株基因組編輯的效率，對(duì)KD1、KD2細(xì)胞株的總蛋白進(jìn)行了Western Blot實(shí)驗(yàn)，用野生型293T細(xì)胞做陰性對(duì)照。結(jié)果顯示KD1、KD2細(xì)胞株中的PLAC8蛋白已經(jīng)被完全敲除 (圖 3-d)。

A： KD1、KD2與WT的基因組序列對(duì)比；b:KD1、KD2基因組測(cè)序峰圖；c:以KD2為例，編輯細(xì)胞株錯(cuò)配酶驗(yàn)證結(jié)果，其中P為陽性對(duì)照 (Genloci CruiserTM基因敲除檢測(cè)試劑盒中自帶的陽性對(duì)照)，KD2為被檢測(cè)的敲除細(xì)胞系，WT為陰性對(duì)照，M為DNA Marker DL2000；d:Western Blot結(jié)果

圖3 PLAC8敲除細(xì)胞株的驗(yàn)證

Figure 3 Identification of PLAC8 knockout cell line

2.3 PLAC8蛋白表達(dá)下調(diào)對(duì)293T細(xì)胞增殖的影響

將KD1、KD2細(xì)胞系與野生型293T細(xì)胞系，分別取對(duì)數(shù)期細(xì)胞以2000/孔的細(xì)胞密度接種到96孔板中，用5 mg/mL的MTT檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度并分析數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示KD1、KD2細(xì)胞系的生長(zhǎng)速度均明顯慢于WT細(xì)胞系，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (圖 4-a)。

A:MTT結(jié)果圖；b:與細(xì)胞增殖相關(guān)的4個(gè)基因在Plac8基因敲除細(xì)胞系 (KD2&KD1) 和野生型 (WT)中蛋白的表達(dá)量

圖4 PLAC8表達(dá)下調(diào)對(duì)293T細(xì)胞增殖的影響

Figure 4 Down-regulated PLAC8 inhibits proliferation of 293T cells

為了進(jìn)一步分析PLAC8 敲除影響細(xì)胞增殖可能的分子機(jī)制，通過Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了一系列細(xì)胞增殖相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示 (圖 4-b)，能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的蛋白激酶B/AKT及核內(nèi)原癌基因C-MYC表達(dá)下調(diào)，MAPK上游激酶RAF-1和胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK2表達(dá)上調(diào)。因此我們推測(cè)敲除PLAC8蛋白能改變ERK/MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)變化，從而抑制細(xì)胞的增殖。

3 討論

PLAC8是一種在多種癌細(xì)胞中表達(dá)并能調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的蛋白。目前，國(guó)內(nèi)外在細(xì)胞水平上研究PLAC8時(shí)都會(huì)用到基因編輯細(xì)胞系，其構(gòu)建方式大多是使用CRISPR/Cas9基因編輯方法構(gòu)建載體-sgRNA敲除重組質(zhì)粒，再將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入病毒包裝細(xì)胞中，收集病毒上清液轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后用嘌呤霉素或者G418等抗生素進(jìn)行篩選。通過提取基因組測(cè)序，篩選出敲除成功的細(xì)胞，再對(duì)敲除成功的細(xì)胞通過有限稀釋法將細(xì)胞分成單克隆，最后在96孔板中培養(yǎng)。但是以上的方法操作起來十分繁瑣，尤其是病毒實(shí)驗(yàn)需要成熟的技術(shù)和高要求的平臺(tái)，有限稀釋法需要大量的重復(fù)性工作，也不能確保能將細(xì)胞全部分為單克隆。

在本課題中，我們首先利用流式細(xì)胞術(shù)與CRISPR/Cas9基因編輯方法相結(jié)合來解決構(gòu)建基因編輯細(xì)胞系過程中病毒包裝轉(zhuǎn)染效率低下及篩選目的細(xì)胞繁瑣的瓶頸，以簡(jiǎn)便、高效、無毒的方法獲得了PLAC8蛋白敲除人胚腎細(xì)胞系。后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在293T細(xì)胞系中，PLAC8蛋白表達(dá)下調(diào)會(huì)抑制細(xì)胞增殖，進(jìn)一步的Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型293T細(xì)胞相比，敲除PLAC8蛋白的293T細(xì)胞中，AKT，C-MYC基因的蛋白表達(dá)水平顯著下降，ERK2，RAF-1基因的表達(dá)水平顯著上升。AKT作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[11-12]。RAF-1，ERK2和C-MYC是ERK/MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，RAF-1作為MAPK激酶激酶，激活后可以引起MAPK信號(hào)通路的活化，促使細(xì)胞增殖周期失調(diào)[13]。同時(shí)RAF-1的持續(xù)表達(dá)也可刺激抑制性因子P21cip1表達(dá)，使該因子與cdk2或cdk4結(jié)合增多而阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖[14]。ERK2是MAPK家族的一員，處于RAF-1的下游，調(diào)控信號(hào)通過ERK2從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核，調(diào)控核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子C-MYC表達(dá)，繼而影響基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞增殖[14]。

綜上所述，我們推測(cè)在293T細(xì)胞中PLAC8可能是通過刺激AKT以及RAF-1-ERK2-C-MYC信號(hào)級(jí)聯(lián)通路調(diào)控細(xì)胞增殖。接下來我們還將通過后續(xù)蛋白水平上的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步來驗(yàn)證其分子機(jī)制。本課題的研究一方面可將已證實(shí)可用的sgRNA用于后續(xù)編輯其他細(xì)胞系，另一方面也可以利用構(gòu)建的敲除細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)動(dòng)物水平上的實(shí)驗(yàn)，如裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)等，用以進(jìn)一步研究PLAC8蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的功能。