賀 燕 譚純良 - 李 娜 周紅麗 - 王曉慶 -

(1. 湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410111；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

雞蛋干是中國(guó)市面上常見(jiàn)的佐餐食品，因其風(fēng)味獨(dú)特而深受消費(fèi)者喜愛(ài)。由于生產(chǎn)原料以全蛋液為主，操作不當(dāng)容易使雞蛋干受微生物污染而變質(zhì)[1]。筆者在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)預(yù)包裝雞蛋干即便經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌后還會(huì)出現(xiàn)脹包、湯汁渾濁、有異味的變質(zhì)現(xiàn)象，尤其是夏秋高溫季節(jié)雞蛋干發(fā)生腐敗變質(zhì)現(xiàn)象機(jī)率更高。課題前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高溫殺菌以后出現(xiàn)腐敗變質(zhì)的雞蛋干的主要腐敗細(xì)菌為地衣芽孢桿菌和芽孢桿菌LAMI 002兩種，但目前未見(jiàn)對(duì)雞蛋干中這兩種腐敗菌的抑制或殺滅技術(shù)的研究報(bào)道。

雞蛋干屬于熱凝固蛋制品。根據(jù)GB 2760—2014對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)及其鈉鹽、乳酸鏈球菌素、山梨酸鉀、山梨酸4種防腐劑可添加至雞蛋干中，但單獨(dú)加入這4種防腐劑難以取得較好的防腐效果。ε-聚賴(lài)氨酸、納他霉素、溶菌酶3種生物防腐劑具有安全性高、抑菌效果好、抑菌譜廣的特點(diǎn)，且在蛋卷、中西式糕、蛋黃醬、沙拉醬等產(chǎn)品中的防腐應(yīng)用效果佳[2]。因此，試驗(yàn)擬以地衣芽孢桿菌和芽孢桿菌LAMI 002為抑制對(duì)象，通過(guò)抑菌試驗(yàn)從上述7種防腐劑中篩選高效防腐劑并優(yōu)化復(fù)配防腐劑配比，以期獲得一種高效的雞蛋干防腐劑，為延長(zhǎng)雞蛋干的貨架期和保障食用安全性提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

菌種：地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、芽孢桿菌LAMI 002(Bacillussp. LAMI 002)，從腐敗雞蛋干中分離純化得到；

山梨酸鉀、對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)及其鈉鹽、納他霉素、乳酸鏈球菌、ε-聚賴(lài)氨酸、溶菌酶：食品級(jí),純度99.0%，浙江一諾生物科技有限公司；

無(wú)水乙醇、NaCl：AR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

結(jié)晶紫：AR級(jí)，北京索萊寶科技有限公司；

濾膜：0.22 μm，德國(guó)Membrana公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外光柵分光光度計(jì)：752型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

光電分析天平：FA2004型，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：DGG型，天津天宇機(jī)電有限公司；

高壓蒸汽滅菌鍋：YXQG01型，山東新華醫(yī)療器械廠；

全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：Multiskan FC型，美國(guó)Thermo Labsystem公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

雞蛋干培養(yǎng)基：稱(chēng)取正常雞蛋干約30.0 g，切成1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm片狀，放置于培養(yǎng)皿中，于121 ℃，15 min滅菌后備用，24 h內(nèi)使用；

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂：北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.4 相關(guān)溶液

1 mol/L HCl溶液：量取83.3 mL濃HCl，用蒸餾水定容至1 L；

3.0 g/kg納他霉素備用液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.30 g納他霉素，用0.02 mol/L HCl溶解并定容至100 mL，24 h內(nèi)使用；

1.5 g/kg山梨酸鉀備用液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.15 g山梨酸鉀，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，用0.22 μm濾膜無(wú)菌條件下過(guò)濾，24 h內(nèi)使用；

2.0 g/kg乳酸鏈球菌素備用液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.20 g乳酸鏈球菌素，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，使用前搖勻并于24 h內(nèi)使用；

2.0 g/kgε-聚賴(lài)氨酸備用液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.20 gε-聚賴(lài)氨酸，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，用0.22 μm濾膜無(wú)菌條件下過(guò)濾，24 h內(nèi)使用；

2.0 g/kg溶菌酶?jìng)溆靡海簻?zhǔn)確稱(chēng)取0.20 g溶菌酶，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，用0.22 μm濾膜無(wú)菌條件下過(guò)濾，24 h內(nèi)使用；

2.0 g/kg對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)及其鈉鹽備用液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)及其鈉鹽，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，用0.22 μm濾膜無(wú)菌條件下過(guò)濾，24 h內(nèi)使用。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

(1) 單一菌菌懸液的制備：參考Veronica等[3-6]的方法，分別將地衣芽孢桿菌和芽孢桿菌LAMI 002接種到5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，取1 mL菌懸液以10 000 r/min離心10 min，用無(wú)菌生理鹽水洗絳沉淀，然后將沉淀重懸于0.5 mL無(wú)菌生理鹽水中，得到107CFU/mL 的菌懸液，備用。

(2) 混合菌菌懸液的制備：前期研究中從腐敗雞蛋干中分離、培養(yǎng)得到的地衣芽孢桿菌和芽孢桿菌LAMI 002的菌落數(shù)比例約為1∶1，因此將上述制備的兩種單一菌的菌懸液按體積比1∶1進(jìn)行混合，獲得混合菌懸液，備用。

1.2.2 不同防腐劑對(duì)混合腐敗細(xì)菌的抑菌效果 根據(jù)GB 2760—2014對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)及其鈉鹽、乳酸鏈球菌素、山梨酸鉀、山梨酸在雞蛋干制品中的最大添加量分別為0.20，0.25，1.50，1.50 g/kg。依據(jù)文獻(xiàn)資料[7-9]試驗(yàn)設(shè)置ε-聚賴(lài)氨酸、納他霉素、溶菌酶最大添加量分別為0.15，0.03，0.50 g/kg。試驗(yàn)中每種防腐劑的濃度設(shè)置成3個(gè)梯度，分別為上述最大允許添加量、1/2最大添加量、1/4最大添加量。

對(duì)以上7種防腐劑進(jìn)行牛津杯抑菌試驗(yàn)：將已滅菌的平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基加熱到完全融化，倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿15～20 mL，待培養(yǎng)基凝固后使用移液器吸取1.2.1中混合菌菌懸液100 μL置于培養(yǎng)皿表面，使用涂布法將菌液涂布均勻。將牛津杯垂直放置在培養(yǎng)基表面并輕輕加壓以接觸介質(zhì)而沒(méi)有空隙。分別在杯中加入不同種類(lèi)不同濃度的防腐劑溶液150 μL。標(biāo)記牛津杯擺放位置、防腐劑類(lèi)型及其濃度，并將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h。以未添加防腐劑的為空白對(duì)照組，用游標(biāo)卡尺對(duì)結(jié)果進(jìn)行記錄。

1.2.3 單一優(yōu)選防腐劑最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定 將一定量的防腐劑加入LB液體培養(yǎng)基中以制備含有不同濃度防腐劑的LB培養(yǎng)基，然后進(jìn)行2倍梯度稀釋?zhuān)礉舛鹊慕敌蛞来渭尤氲?×12型無(wú)菌96孔板中，每孔添加200 μL，再向每孔中加入細(xì)菌菌懸液5 μL。添加后，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值OD600 nm，然后將含有細(xì)菌的96孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h。每隔2 h使用酶標(biāo)儀測(cè)每孔OD600 nm一次，兩個(gè)相鄰濃度在培養(yǎng)12 h后△OD600 nm≤20%則兩者濃度大的為該防腐劑的最小抑菌濃度。第11孔不加防腐劑作為生長(zhǎng)對(duì)照，第12孔不加菌液作為空白對(duì)照，若空白對(duì)照污染，則試驗(yàn)失敗，每組試驗(yàn)4次平行[10]。

在無(wú)菌條件下，從MIC和大于MIC濃度的孔中取出100 μL培養(yǎng)液，然后涂布到LB平板上，將細(xì)菌置于37 ℃培養(yǎng)箱中12 h。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察菌落總數(shù)并計(jì)數(shù)，MBC為無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低防腐劑培養(yǎng)濃度。

1.2.4 單一優(yōu)選防腐劑對(duì)地衣芽孢桿菌和芽孢桿菌LAMI 002混合菌的抑制效果 以腐敗雞蛋干中的腐敗細(xì)菌地衣芽孢桿菌和芽孢桿菌 LAMI 002的混合菌懸液作為供試樣品，檢驗(yàn)單一防腐劑溶菌酶、ε-聚賴(lài)氨酸、乳酸鏈球菌素的抑菌效果。參照GB 2760—2014及相關(guān)文獻(xiàn)[11-12]食品添加劑最大允許添加量，分別制備含不同濃度的防腐劑(各防腐劑最大允許添加量的100%，85%，70%，55%，40%，25%，10%，0%)的LB培養(yǎng)基，根據(jù)1.2.3 方法進(jìn)行操作后于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h后使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600 nm。每組試驗(yàn)4次平行，以O(shè)D值較小且防腐劑濃度添加量低的相鄰兩防腐劑添加濃度作為優(yōu)化添加濃度范圍。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)配防腐劑配比 根據(jù)單一防腐劑的抑菌效果試驗(yàn)結(jié)果，以O(shè)D600 nm為響應(yīng)值(R)，設(shè)計(jì)三因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)配防腐劑配比，每組試驗(yàn)設(shè)3組平行。

1.2.6 復(fù)配防腐劑抑菌效果驗(yàn)證 在雞蛋干培養(yǎng)基(1.1.3)中添加相應(yīng)劑量復(fù)配防腐劑，同時(shí)以添加相應(yīng)劑量無(wú)菌超純水的空白作為對(duì)照，然后分別接種100 μL混合腐敗菌菌懸液。密封真空包裝后，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，按GB 4789.2—2016測(cè)定樣品中的菌落總數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同防腐劑對(duì)混合腐敗細(xì)菌抑菌效果

從圖1可以看出，最大添加量時(shí)，乳酸鏈球菌素對(duì)混合菌的抑制圈直徑最大，其次是ε-聚賴(lài)氨酸和溶菌酶。乳酸鏈球菌素與溶菌酶的抑菌圈直徑隨著防腐劑濃度的降低明顯減小。當(dāng)乳酸鏈球菌素濃度為0.25 g/kg時(shí)抑菌圈直徑為26.91 mm，相比山梨酸鉀、山梨酸、對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)及其鈉鹽優(yōu)勢(shì)明顯。ε-聚賴(lài)氨酸、溶菌酶兩種抗菌劑的抑菌圈直徑會(huì)隨著添加量的增加而增大，抑菌效果明顯。結(jié)果表明，單一生物防腐劑對(duì)混合菌種的抑制效果優(yōu)于單一化學(xué)防腐劑，可能是腐敗菌種均為芽孢桿菌，對(duì)環(huán)境耐受性較強(qiáng)，而生物防腐劑例如溶菌酶能直接破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁，使其失活。因此選擇ε-聚賴(lài)氨酸、酸溶菌酶和乳酸鏈球菌素作為優(yōu)選防腐劑。

2.2 單一優(yōu)選防腐劑對(duì)腐敗菌株的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

圖2、3分別為單一優(yōu)選防腐劑(乳酸鏈球菌素、ε-聚賴(lài)氨酸和溶菌酶)對(duì)地衣芽孢桿菌和芽孢桿菌LAMI 002的劑量反應(yīng)曲線。

圖1 不同防腐劑對(duì)混合腐敗細(xì)菌抑菌圈大小

圖2 不同防腐劑對(duì)地衣芽孢桿菌的劑量反應(yīng)曲線

圖2(a)中，當(dāng)乳酸鏈球菌濃度為0.250 0 g/kg時(shí)，地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)和代謝被抑制，但菌體細(xì)胞沒(méi)有完全被殺死；提高劑量至2.000 0 g/kg時(shí)，能完全抑制該菌生長(zhǎng)，破壞菌體，使其進(jìn)入衰亡期。圖2(b)中ε-聚賴(lài)氨酸效果在0.125 0 g/kg的條件下，可以完全抑制地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)，增加劑量后效果更好。圖2(c)中溶菌酶的用量需要達(dá)到0.500 0 g/kg才能完全抑制地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)。圖3(a)中乳酸鏈球菌素在0.125 0 g/kg的條件下，可以完全抑制芽孢桿菌的生長(zhǎng)。圖3(b)中單獨(dú)添加ε-聚賴(lài)氨酸時(shí)，需要達(dá)到0.250 0 g/kg的劑量才能對(duì)芽孢桿菌有明顯的抑制效果。圖3(c)中溶菌酶在0.125 0 g/kg時(shí)可以抑制芽孢桿菌的生長(zhǎng)。由圖2、3可知，3種防腐劑的添加量達(dá)到某一濃度時(shí)均能完全抑制地衣芽孢桿菌和芽孢桿菌LAMI 002，但是單一防腐劑不能在允許添加濃度范圍內(nèi)同時(shí)抑制兩種菌的生長(zhǎng)。不同防腐劑的MIC和MBC值如表1所示。

圖3 不同防腐劑對(duì)芽孢桿菌LAMI 002的劑量反應(yīng)曲線

綜上所述，兩種菌對(duì)不同防腐劑的敏感程度不一樣，地衣芽孢桿菌對(duì)ε-聚賴(lài)氨酸最為敏感，對(duì)溶菌酶有較強(qiáng)的耐受作用；芽孢桿菌LAMI 002對(duì)于3種生物防腐劑都比較敏感，只需使用少量防腐劑即可抑制其生長(zhǎng)，但對(duì)ε-聚賴(lài)氨酸的耐受性較強(qiáng)。單一防腐劑在允許添加范圍內(nèi)不能同時(shí)抑制兩種菌的生長(zhǎng)，因而須考慮多種防腐劑的復(fù)配。

2.3 單一優(yōu)選防腐劑對(duì)地衣芽孢桿菌和芽孢桿菌 LAMI 002混合菌的抑制效果

由圖4可以看出，溶菌酶在添加量為40%時(shí)吸光度值出現(xiàn)最小值，因此選擇25%～55%的添加濃度作為優(yōu)化濃度范圍；ε-聚賴(lài)氨酸在添加量為100%時(shí)吸光值出現(xiàn)最小值，在該濃度下腐敗混合菌依舊能生長(zhǎng)，而在添加量為40%時(shí)吸光值出現(xiàn)了次小值且與最大添加濃度的吸光值差值約為0.039，故選擇25%～55%的添加濃度作為優(yōu)

圖4 不同濃度單一防腐劑對(duì)混合菌株吸光值的影響

Figure 4 Effect of single preservative at different concentrations on absorbance

表1 不同防腐劑的MIC和MBC

化濃度范圍；乳酸鏈球菌素在整個(gè)允許添加范圍內(nèi)變化較小，在25%的添加濃度時(shí)吸光值出現(xiàn)最小值，所以選擇10%～40%作為優(yōu)化濃度范圍。

2.4 復(fù)配防腐劑配化的優(yōu)化

2.4.1 試驗(yàn)因素及水平 根據(jù)2.2的防腐劑抑菌效果設(shè)置因素水平見(jiàn)表2。

2.4.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果分析 各因素水平、編碼設(shè)計(jì)及試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果如表3所示。

根據(jù)Design Expert 10軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程模型：

表2響應(yīng)面分析法的因素與水平表

Table 2 Codes and levels of factors for response surface for methodology experiment g/kg

R=0.204+9.188×10-3A+0.016B-3.375×10-3C+0.012AB-8.500×10-3AC+0.032BC+0.013A2+0.031B2+0.051C2。

(1)

對(duì)試驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到回歸方程模型的方差分析與回歸方程系數(shù)估計(jì)值，如表4所示。

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果

由圖5可知，隨著溶菌酶與聚賴(lài)氨酸使用量增多OD600 nm值升高，越不能抑制微生物生長(zhǎng)，可能是ε-聚賴(lài)氨酸和溶菌酶在該濃度下可以抑制混合菌種的某一種菌的生長(zhǎng)，但是不能抑制另一種菌的生長(zhǎng)。由圖6可知，溶菌酶與乳酸鏈球菌素的相互作用中，溶菌酶對(duì)于微生物的抑制效果較為穩(wěn)定，使用量的變化對(duì)抑菌效果影響不大，乳酸鏈球菌素在使用0.062 5 g/kg左右時(shí)出現(xiàn)極小值，由圖7可知，ε-聚賴(lài)氨酸與乳酸鏈球菌素對(duì)于抑制腐敗菌的生長(zhǎng)有一定的交互作用，根據(jù)等高線呈橢圓狀可知其交互作用顯著。

2.4.3 復(fù)配防腐劑配比的確定 根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)所得的結(jié)果與回歸方程，利用Design Expert 10軟件分析可得：復(fù)配防腐劑中各組分配比為溶菌酶0.185 2 g/kg，ε-聚賴(lài)氨酸0.054 1 g/kg，乳酸鏈球菌素0.066 3 g/kg，OD600 nm達(dá)到理論最小值0.201。按該組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(平行3次)，實(shí)測(cè)OD600 nm為0.212，與理論值接近。說(shuō)明試驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值吻合良好。

2.5 復(fù)配防腐劑抑菌效果驗(yàn)證

從表5可以看出，復(fù)配防腐劑組的樣品外表仍然光滑且富有韌性，雞蛋干表面析出的水較少且透明，有雞蛋干固有的微黃色，沒(méi)有腐敗臭味，菌落總數(shù)得到了明顯控制；對(duì)照組樣品表面粗糙，使用玻璃棒輕戳即碎成顆粒狀，表面析出的水呈渾濁狀，顏色和工廠生產(chǎn)的腐敗雞蛋干一致，嚴(yán)重褪色，有濃烈的腐敗味道。目前雞蛋干暫無(wú)國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)通常規(guī)定菌落總數(shù)不得超過(guò)105CFU/g，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h時(shí)已超出該范圍，但復(fù)配防腐劑的僅為2.7×103CFU/g。

表4 回歸方程的方差分析?

? *表示P<0.05水平為顯著，**表示P<0.01水平為極顯著。

圖5 溶菌酶與ε-聚賴(lài)氨酸的交互作用

圖6 溶菌酶與乳酸鏈球菌素的交互作用

圖7 ε-聚賴(lài)氨酸與乳酸鏈球菌素的交互作用

表5 雞蛋干質(zhì)量評(píng)價(jià)

說(shuō)明復(fù)配防腐劑能對(duì)雞蛋干中的腐敗細(xì)菌進(jìn)行有效抑制，防止了產(chǎn)品變質(zhì)。

3 結(jié)論

通過(guò)抑菌試驗(yàn)從7種防腐劑中篩選出ε-聚賴(lài)氨酸、乳酸鏈球菌素和溶菌酶3種高效防腐劑，其中ε-聚賴(lài)氨酸對(duì)地衣芽孢桿菌的抑制效果較好，乳酸鏈球菌素和溶菌酶對(duì)芽孢桿菌LAMI 002的抑制效果較好。通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)確定最佳復(fù)配防腐劑配方為溶菌酶0.185 2 g/kg，ε-聚賴(lài)氨酸0.054 1 g/kg，乳酸鏈球菌素0.066 3 g/kg。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中混合腐敗菌得到了有效控制，菌落總數(shù)減少了99.07%。但此研究目前還僅在實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行小試，未進(jìn)行中試和實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用，實(shí)際生產(chǎn)中可能存在的問(wèn)題和缺陷還有待于發(fā)現(xiàn)和解決。