施利奇 - 張彥青 -ng 戚務(wù)勤 -n 王 輕 解軍波 -

(1. 天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617)

酸棗是中國(guó)華北地區(qū)的傳統(tǒng)野生藥用植物[1]，具有非常好的藥用以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2],是制作天然保健飲品的優(yōu)質(zhì)原料[3]?，F(xiàn)代研究表明，酸棗果肉中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要包括多糖、有機(jī)酸、多種維生素以及礦物質(zhì)等[4-5]，具有鎮(zhèn)靜催眠、抗氧化以及增強(qiáng)腸道屏障的作用[6-8]。目前，市場(chǎng)上酸棗飲料產(chǎn)品主要有酸棗汁[9]、酸棗果醋[10]、酸棗果酒[11]等，其中酸棗汁是最主要的品種。

酸棗果肉中通常含有大量的果膠和纖維物質(zhì)，傳統(tǒng)的棗汁生產(chǎn)主要采用熱水浸提或打漿法，可溶物提取效率低，提取時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)[12-13]。近年來，眾多研究學(xué)者[14-17]針對(duì)棗汁生產(chǎn)開發(fā)了多種提取方法，如超聲法、微波法、酶解法等，與傳統(tǒng)方法相比，這些方法可以使細(xì)胞內(nèi)溶物更好地溶出，提取率明顯提高。但迄今為止，采用超聲聯(lián)合酶解法提取酸棗汁，尤其是不同方法對(duì)酸棗可溶性物提取率及其抗氧化活性的影響研究還未見報(bào)道。

試驗(yàn)擬采用超聲法、酶解法、超聲輔助酶解法3種方法提取酸棗汁，以酸棗可溶性物提取率為指標(biāo)，利用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，并考察不同工藝提取物的抗氧化活性，為深入開發(fā)酸棗資源、提高酸棗汁產(chǎn)品加工水平提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

酸棗果肉：干制品，產(chǎn)地天津薊縣；

果膠酶(最適pH 4.0，溫度50 ℃，酶活10萬U/g)：河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；

纖維素酶(最適pH 4.0，溫度50 ℃，酶活5萬U/g)：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；

檸檬酸：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；

DPPH、ABTS：美國(guó)Sigma公司；

其他試劑：分析純，天津市化學(xué)試劑供銷公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DH-101型，天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；

高速萬能粉碎機(jī)：FW100型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

電子天平：ME204型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

pH計(jì)：FE20型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

恒溫水浴鍋：TDA-8002型，天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500B型，昆山市超聲儀器有限公司；

離心機(jī)：Heraeus Megafuge 8R型，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；

折射計(jì)：PAL-1型，ATAGO(愛拓)中國(guó)分公司；

多功能讀板機(jī)：SpectraMax-M5型，美國(guó)Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理 稱取干燥酸棗果肉2.0 g于50 mL離心管中，加入一定量的水，60 ℃浸泡1 h，酶解法和超聲輔助酶解法需要用檸檬酸和pH計(jì)調(diào)節(jié)pH為4左右。

1.2.2 超聲法提取工藝的優(yōu)化

(1) 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響：固定液料比7∶1 (mL/g)，超聲溫度50 ℃，超聲功率100 W。分別在超聲時(shí)間為10，20，30，40，50 min時(shí)提取酸棗果肉，考察超聲時(shí)間對(duì)酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(2) 超聲功率對(duì)提取率的影響：固定液料比7∶1 (mL/g)，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)30 min。分別在超聲功率為100，120，140，160，180 W時(shí)提取酸棗果肉，考察超聲功率對(duì)酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(3) 超聲溫度對(duì)提取率的影響：固定液料比7∶1 (mL/g)，超聲時(shí)間30 min，超聲功率100 W。分別在超聲溫度為40，50，60，70，80 ℃時(shí)提取酸棗果肉，考察超聲溫度對(duì)酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(4) 液料比對(duì)提取率的影響：固定超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間30 min，超聲功率100 W。分別在液料比為5∶1，7∶1，9∶1，11∶1，13∶1 (mL/g) 時(shí)提取酸棗果肉，考察液料比對(duì)酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(5) 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇有顯著影響的4個(gè)因素，以酸棗果肉可溶性物提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)酸棗果肉超聲法提取工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。

1.2.3 酶解法提取工藝的優(yōu)化

(1) 酶配比對(duì)提取率的影響：固定酶解溫度50 ℃，加酶量2.1%，酶解時(shí)間1.5 h。分別在酶配比方式為水(A)、果膠酶(B)、纖維素酶(C)、果膠酶∶纖維素酶=1∶1(D)、果膠酶∶纖維素酶=1∶2(E)、果膠酶∶纖維素酶=2∶1(F)時(shí)提取酸棗果肉，考察不同酶配比對(duì)酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(2) 液料比對(duì)提取率的影響：固定酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間1 h，加酶量1.5%。分別在液料比為5∶1，7∶1，9∶1，11∶1，13∶1 (mL/g) 時(shí)提取酸棗果肉，考察液料比對(duì)酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(3) 酶解溫度對(duì)提取率的影響：固定液料比7∶1 (mL/g)，酶解時(shí)間1 h，加酶量1.5%。分別在酶解溫度為40，45，50，55，60 ℃時(shí)提取酸棗果肉，考察酶解溫度對(duì)酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(4) 酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響：固定液料比7∶1 (mL/g)，酶解溫度50 ℃，加酶量1.5%。分別在酶解時(shí)間為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h時(shí)提取酸棗果肉，考察酶解時(shí)間對(duì)酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(5) 加酶量對(duì)提取率的影響：固定液料比7∶1 (mL/g)，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間1 h。分別在加酶量為0.9%，1.5%，2.1%，2.7%，3.3% 時(shí)提取酸棗果肉，考察加酶量對(duì)酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(6) 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇有顯著影響的4個(gè)因素，以酸棗果肉可溶性物提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)酸棗果肉酶解法提取工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。

1.2.4 超聲輔助酶解法提取工藝的優(yōu)化

(1) 液料比對(duì)提取率的影響：固定酶解溫度和超聲溫度均為50 ℃、加酶量1.5%、酶解時(shí)間1 h、超聲時(shí)間30 min、超聲功率120 W。分別在液料比為7∶1，9∶1，11∶1，13∶1，15∶1 (mL/g) 時(shí)提取酸棗果肉，考察液料比對(duì)酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(2) 加酶量對(duì)提取率的影響：固定酶解溫度和超聲溫度均為50 ℃，液料比9∶1 (mL/g)，酶解時(shí)間1 h，超聲時(shí)間30 min，超聲功率120 W。分別在加酶量為0.9%，1.5%，2.1%，2.7%，3.3%時(shí)提取酸棗果肉，考察液料比對(duì)酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(3) 酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響：固定酶解溫度和超聲溫度均為50 ℃，液料比9∶1 (mL/g)，加酶量1.5%，超聲時(shí)間30 min，超聲功率120 W。分別在酶解時(shí)間為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h時(shí)提取酸棗果肉，考察酶解時(shí)間對(duì)酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(4) 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響：固定酶解溫度和超聲溫度均為50 ℃，液料比9∶1 (mL/g)，加酶量1.5%，酶解時(shí)間1 h，超聲功率120 W。分別在超聲時(shí)間為10，20，30，40，50 min時(shí)提取酸棗果肉，考察超聲時(shí)間對(duì)酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(5) 超聲功率對(duì)提取率的影響：固定酶解溫度和超聲溫度均為50 ℃，液料比9∶1 (mL/g)，加酶量1.5%，酶解時(shí)間1 h，超聲時(shí)間30 min。分別在超聲功率為100，120，140，160，180 W時(shí)提取酸棗果肉，考察超聲功率對(duì)酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(6) 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇有顯著影響的4個(gè)因素，以酸棗果肉可溶性物提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)酸棗果肉提取工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。

1.2.5 可溶性物提取率的測(cè)定 酸棗果肉提取后，離心(8 000 r/min，8 min)，得澄清酸棗汁，利用PAL-1型折光儀測(cè)定可溶性固性物含量，并按式(1)計(jì)算可溶性物質(zhì)提取率。

(1)

式中：

c——可溶性物質(zhì)提取率，%；

s——棗汁中的可溶性固性物含量，%；

m——酸棗汁質(zhì)量，g；

M——酸棗果肉質(zhì)量，g。

1.2.6 總酚含量的測(cè)定 采用福林酚法[18]，以沒食子酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(曲線方程為y=0.002x+0.076，R2=0.999 0)，按式(2)計(jì)算總酚含量。

(2)

式中：

R1——酸棗汁中總酚含量，mg/g；

C——待測(cè)液總酚質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——澄清酸棗汁體積，mL；

當(dāng)然，以上未列出的山西杰出學(xué)者尚多，僅清代就有孫嘉淦及徐潤(rùn)第、徐繼畬父子等人。 而從三晉學(xué)術(shù)史或中國(guó)學(xué)術(shù)史的角度來看，以上所列學(xué)術(shù)團(tuán)體及重要學(xué)人，皆對(duì)當(dāng)時(shí)及后世的學(xué)術(shù)產(chǎn)生過一定的影響，其中皆有本省學(xué)者與外地名宦、寓賢交流互動(dòng)的痕跡。

Y——可溶性固形物含量，%。

1.2.7 總糖含量的測(cè)定 采用苯酚硫酸法[19]，以葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(曲線方程為y=0.003 2x+0.151 9，R2=0.995 7)，按式(3)計(jì)算總糖含量。

(3)

式中：

R2——酸棗汁中總糖含量，mg/g；

C——待測(cè)液總糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——澄清酸棗汁體積，mL；

Y——可溶性固形物含量，%。

1.2.8 體外氧化活性測(cè)定 取3種方法所制備澄清酸棗汁，測(cè)定可溶性固形物含量，將酸棗汁稀釋至濃度為6 mg/mL，進(jìn)行體外抗氧化試驗(yàn)。分別測(cè)定其ABTS清除活性[20]、DPPH清除活性[21]以及羥自由基清除活性[22]。清除能力以每克可溶性固形物的VC微摩爾當(dāng)量表示(μmol VC/g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，利用Prism軟件、SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行繪圖和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲法提取工藝優(yōu)化

如圖1所示，最佳超聲時(shí)間為40 min，最佳超聲功率為140 W，最佳超聲溫度為70 ℃，最佳液料比為11∶1(mL/g)。因此，確定超聲法響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的因素及水平取值見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

采用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，建立提取工藝的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=66.41-0.025A+0.47B+0.37C+1.61D-0.53AB+0.37AC-0.43AD-1.18BC+0.12BD-2.50CD-1.46A2-1.10B2-1.07C2-2.34D2。

(4)

由表3可知，B、C、D均對(duì)酸棗水溶性物質(zhì)提取率具有顯著影響，各因素的影響大小為D>B>C>A。該模型具有極顯著性(P<0.01)，失擬項(xiàng)P值不顯著(P>0.05)，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.969 1，表明該模型擬合程度好，試驗(yàn)誤差較小，該模型可用于預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。最佳條件為超聲時(shí)間36 min，超聲功率155 W，超聲溫度60 ℃，液料比13∶1 (mL/g)，按此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，酸棗可溶性物質(zhì)提取率為67.37%，與預(yù)測(cè)值(67.63%)相比，誤差較小，能較好反映出各因素與酸棗可溶性物質(zhì)提取率之間關(guān)系。

表1 超聲法Box-Behnken試驗(yàn)因素和水平表

圖1 超聲法各單因素對(duì)酸棗可溶性物質(zhì)提取率的影響

Figure 1 Effect of single factor on the extraction rate of sour jujube juice by ultrasonic method

表2 超聲法響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2 酶解法提取工藝優(yōu)化

如圖2所示，最佳酶配比為果膠酶與纖維素酶1∶2，最佳液料比為9∶1 (mg/mL)，最佳加酶量為2.1%，最佳酶解時(shí)間為1.5 h，最佳酶解溫度為50 ℃。果膠酶和纖維素酶可以使酸棗細(xì)胞壁中的果膠和纖維素水解[23-24]組織結(jié)構(gòu)松散，溶解出更多的可溶性物，從而提高提取率[25]。而且試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膠酶∶纖維素酶為1∶2時(shí)酸棗可溶性物質(zhì)提取率顯著高于其他試驗(yàn)組。因此，酶解法和超聲輔助酶解法均選擇果膠酶∶纖維素酶為1∶2。確定酶解法響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的因素及水平取值見表4，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，建立提取工藝的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=69.91+1.48A+0.94B-0.17C+0.24D+0.010AB+0.100AC-0.63AD+0.67BC-0.31BD-0.37CD-3.00A2-0.85B2-1.58C2-0.52D2。

(5)

表3 超聲法方差分析結(jié)果?

? *表示有顯著差異(P<0.05)；**表示有非常顯著差異(P<0.01)；***表示有極顯著差異(P<0.001)。

*. 顯著差異(P<0.05) **. 非常顯著差異(P<0.01) ***. 極顯著差異(P<0.001)

表4 酶解法Box-Behnken試驗(yàn)因素和水平表

由表6可知，A、B對(duì)酸棗可溶性物質(zhì)提取率具有顯著影響，各因素的影響大小為A>B>D>C。該模型具有極顯著性(P<0.01)，失擬項(xiàng)P值不顯著(P>0.05)，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.968 3，表明該模型擬合程度好，試驗(yàn)誤差較小，該模型可用于預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。最佳條件為液料比11∶1 (mL/g)，酶解溫度47 ℃，酶解時(shí)間1.6 h，加酶量2.5%，按此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，酸棗可溶性物質(zhì)提取率為69.47%，與預(yù)測(cè)值(69.38%)相比，誤差較小，能較好反映出各因素與酸棗可溶性物質(zhì)提取率之間關(guān)系。

2.3 超聲輔助酶解法提取工藝優(yōu)化

如圖3所示，最佳液料比為13∶1 (mL/g)，最佳酶解時(shí)間為1 h，最佳超聲時(shí)間為30 min，最佳超聲功率為140 W，最佳加酶量為2.1%。由于加酶量對(duì)提取率的影響變化較小，固定加酶量為2.1%。因此，確定超聲法響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的因素及水平取值見表7，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表8。

采用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表8中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，建立提取工藝的二次多項(xiàng)回歸方程：

表5 酶解法響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表6 酶解法方差分析結(jié)果?

? *表示有顯著差異(P<0.05)；**表示有非常顯著差異(P<0.01)；***表示有極顯著差異(P<0.001)。

表7超聲輔助酶解法Box-Behnken試驗(yàn)因素和水平表

Table 7 Box-Behnken test factors and level tables by ultrasound-assisted enzymatic extraction method

編號(hào)A 液料比(mL/g)B 酶解時(shí)間/hC 超聲時(shí)間/minD 超聲功率/W-111︰10.520120013︰11.030140115︰11.540160

Y=74.62+0.37A+0.76B+0.016C+0.39D+0.092AB-0.36AC+0.049AD-0.64BC-0.39BD+0.099CD-1.20A2-0.62B2-1.39C2-0.26D2。

(6)

由表9可知，A、B、D均對(duì)酸棗可溶性物質(zhì)提取率影響顯著，各因素的影響大小為B>D>A>C。該模型具有極顯著性(P<0.01)，失擬項(xiàng)P值不顯著(P>0.05)，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.965 8，表明該模型擬合程度好，試驗(yàn)誤差較小，該模型可用于預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。最佳條件為液料比13∶1 (mL/g)，加酶量2.1%，酶解時(shí)間1.2 h，超聲時(shí)間29 min，超聲功率146 W，按此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，酸棗可溶性物質(zhì)提取率為74.82%，與預(yù)測(cè)值(74.49%)相比，誤差較小，能較好反映出各因素與酸棗可溶性物質(zhì)提取率之間關(guān)系。

目前已報(bào)道酸棗汁提取方法主要為酶解法。毛麗衡[3]和杜琨[26]均采用果膠酶對(duì)酸棗進(jìn)行提取，提取率分別為66.10%和67.23%。試驗(yàn)中3種方法的提取率(67.74%，69.38%，74.49%)均高于已報(bào)道酸棗提取率，與超聲法和酶解法相比，超聲輔助酶解法提取率明顯提高，表明超聲輔助酶解法是一種更加高效、方便的提取方法。

表8超聲輔助酶解法響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table 8 Response surface design and results by ultrasound-assisted enzymatic extraction method

序號(hào)ABCD提取率/%1-1-10071.8721-10072.233-110073.014110073.73500-1-172.436001-172.66700-1172.898001173.529-100-172.4710100-173.2711-100172.9312100173.92130-1-1071.341401-1073.93150-11072.5516011072.5717-10-1071.501810-1072.9919-101071.9620101072.02210-10-171.9022010-174.61230-10173.8224010174.9825000074.6526000074.8027000074.42

圖3 超聲輔助酶解法各單因素對(duì)酸棗可溶性物質(zhì)提取率的影響

表9 超聲輔助酶解法方差分析結(jié)果?

? *表示有顯著差異(P<0.05)；**表示有非常顯著差異(P<0.01)；***表示有極顯著差異(P<0.001)。

2.4 不同方法提取物總酚、總糖含量的比較

如表10所示，不同提取方法對(duì)酸棗汁中的總酚含量無顯著影響，而對(duì)總糖含量影響顯著；與超聲法和酶解法相比，超聲輔助酶解法可以顯著提高酸棗汁中總糖含量。

2.5 酸棗汁抗氧化活性

如圖4所示，3種方法提取的酸棗汁表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。與超聲法相比，酶解法可以顯著提高酸棗汁清除羥自由基和DPPH自由基的能力，超聲輔助酶解法顯著提高酸棗汁清除ABTS自由基、羥自由基以及DPPH自由基的能力；超聲輔助酶法酸棗汁DPPH自由基清除能力強(qiáng)于酶法(P<0.05)。由以上可知，超聲輔助酶解法提取的酸棗汁抗氧化能力要優(yōu)于其他兩種方法，不同抗氧化能力可能與酸棗汁中總糖含量的差異有關(guān)。

表10 酸棗汁中總酚和總糖含量測(cè)定?

? 同列字母不同代表差異顯著(P<0.05)。

字母不同代表差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化超聲法、酶解法及超聲輔助酶解法提取酸棗汁的工藝條件。結(jié)果表明，3種方法的酸棗水溶物提取率均優(yōu)于已報(bào)道文獻(xiàn)[3,26]的，其中超聲輔助酶解法的提取效果最佳。酸棗汁具有明顯的抗氧化能力，與其總酚、總糖含量密不可分，并且不同方法提取的酸棗汁抗氧化能力具有顯著差異，可能與總糖含量的差異有關(guān)。與超聲法和酶解法相比，超聲輔助酶解法不僅可以有效提高酸棗可溶物提取率和總糖含量，還可以顯著提高其抗氧化能力，因此超聲輔助酶解提取可以作為一種高效的酸棗汁提取方法。后續(xù)將進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)以進(jìn)一步驗(yàn)證不同方法提取酸棗汁的抗氧化能力。