陳景春 -

(上海必諾檢測技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 201114)

敵菌靈化工產(chǎn)品學(xué)名2,4-二氯-6-(鄰氯代胺基)均三氮苯，由三聚氰酰氯與鄰氯苯胺在脫酸劑存在下作用而得到的一種殺菌劑，外觀為白色至黃色結(jié)晶，熔點159～160 ℃，能溶于鏈烴類和其他多數(shù)有機試劑，如甲苯、二甲苯、丙酮等(在堿性介質(zhì)中30 ℃以下即可分解)[1-2]。敵菌靈具有低毒、內(nèi)吸性和殺菌譜較廣等特點[3]，主要用于防治瓜類中常見的黑星病、炭疽病、霜霉病，水稻中的稻瘟病、胡麻葉斑病、煙草赤星病，番茄斑枯病以及各種農(nóng)作物中常見的灰霉病等。

農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中無可避免地被使用，對環(huán)境和生物鏈均有極大的破壞性，而水果、蔬菜上的農(nóng)藥殘留問題也是由來已久的，已經(jīng)對人體健康和生命安全造成了嚴(yán)重的威脅[4]。隨著人類對農(nóng)藥殘留問題的日益重視，日本、美國及歐盟國家都制定了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定了在水果、蔬菜和糧食中的最大殘留限量值，并對其殘留量進(jìn)行監(jiān)測。日本農(nóng)藥注冊保留標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定果品(草莓除外)、蔬菜、甜菜等敵菌靈最大殘留量(MRL)值為10 mg/kg、草莓為20 mg/kg，中國在GB 2763—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了敵菌靈在黃瓜和番茄中的最大殘留量(MRL)值為10 mg/kg。

農(nóng)藥殘留分析的樣品種類繁多，化學(xué)組成復(fù)雜，要使分析儀器能檢測到痕量的殘留農(nóng)藥，需對樣品進(jìn)行必要的提取、濃縮和凈化處理[5-6]。固相萃取是近年發(fā)展起來的一種樣品預(yù)處理技術(shù)，由液固萃取和液相色譜柱技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來，能有效地將分析物與干擾組分分離，減少樣品預(yù)處理過程，操作簡單、省時、省力，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的分析中[7]。目前，測定蔬菜、水果中敵菌靈農(nóng)藥殘留量的檢測文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)方法主要集中在高效液相色譜法[8-10]和氣質(zhì)聯(lián)用法[11-12]等，但液相色譜及氣質(zhì)聯(lián)用法在實際使用中，存在靈敏度較低，選擇性較差、分子離子峰難以識別、不能準(zhǔn)確區(qū)分干擾物及目標(biāo)物等缺點，文獻(xiàn)[12]使用液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法檢測敵菌靈但并未對樣品進(jìn)行凈化及濃縮。

試驗擬通過固相萃取進(jìn)行凈化，結(jié)合高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜高選擇性、高靈敏性的優(yōu)勢，對組分復(fù)雜的樣品進(jìn)行實時分析，以期能夠提供精準(zhǔn)的目標(biāo)物結(jié)構(gòu)信息、相對分子質(zhì)量等信息，為判定目標(biāo)物提供依據(jù)。

1 試驗部分

1.1 試驗設(shè)備

電子分析天平：BP211D型，德國Sartorius公司；

高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 1290+6470型，美國安捷倫公司；

高速冷凍離心機：Sovall ST16R型，美國賽默飛世爾公司；

漩渦振蕩器：Basic Vortex Mixer型，美國Talboys公司；

氮吹儀：DC-24型，上海安譜實驗室科技股份有限公司。

1.2 材料與試劑

番茄、黃瓜：購自上海大潤發(fā)超市；

乙腈、正己烷、甲醇、丙酮、甲酸：色譜純，美國Sigma公司；

氯化鈉：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

敵菌靈標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：(99.0±1.0)%，德國Dr. Ehrenstorfer公司；

弗羅里硅土(Florisil)固相萃取柱：500 mg/6 mL，美國Waters公司。

1.3 樣品提取及凈化

準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的樣品10 g(精確到0.01 g)于50 mL 離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL乙腈溶液，用高速勻漿機均質(zhì)1 min，加入3～5 g氯化鈉于離心管中，蓋上瓶蓋，于渦旋振蕩器上劇烈振蕩5 min。在4 ℃條件下，以8 000 r/min 離心10 min，移取乙腈層至圓底燒瓶中，殘渣用20 mL乙腈反復(fù)提取1次，合并乙腈層，于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入3.0 mL正己烷振蕩溶解，待凈化。

依次使用3 mL正己烷—丙酮溶液(體積比85∶15)和正己烷分別預(yù)淋洗弗羅里硅土固相萃取柱，待正己烷接近流盡時，加入待凈化液， 用50 mL梨形瓶接收洗脫液，用15 mL正己烷—丙酮溶液(體積比85∶15)分3次沖洗圓底燒瓶后過弗羅里硅土固相萃取柱，收集洗脫液，在40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。用1 mL甲醇溶液溶解，經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾，待上質(zhì)譜分析。

1.4 液相及質(zhì)譜分析條件

1.4.1 液相部分 色譜柱：Infinitylab Poroshell 120 EC-C18(2.7 μm，3.0 mm ×100 mm)；流動相：A為甲醇，B為0.1%甲酸水溶液(流動相梯度洗脫條件具體見表1)；流動相流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；色譜柱溫：40 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜部分 離子源類型：電噴霧離子源(ESI)；離子源溫度：150 ℃；電噴霧電壓：1.2 kV；毛細(xì)管電壓：3 500 V；

表1 流動相梯度洗脫條件

掃描方式及監(jiān)測方式分別為正離子掃描及多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流量：11 L/min；去溶劑氣流量：11 L/min；去溶劑氣溫度：350 ℃；霧化氣壓力：172 kPa；在正離子掃描模式下，直接進(jìn)樣敵菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)行母離子全掃描，確定以分子離子m/z275為母離子，然后對其進(jìn)行子離子掃描，得到2個監(jiān)測離子分別為153和214，并且通過調(diào)節(jié)毛細(xì)管電壓，錐孔電壓及碰撞能量等，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，并得到最終結(jié)果。具體數(shù)值見表2。

表2 敵菌靈的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)

1.5 標(biāo)準(zhǔn)貯備液及標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制

準(zhǔn)確稱取敵菌靈農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容，得到濃度為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液，并置于4 ℃冰箱保存。分別吸取適量敵菌靈農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用甲醇稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作液，在空白基質(zhì)中分別添加0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg的敵菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品同樣處理后上機測定，得到敵菌靈的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。敵菌靈標(biāo)準(zhǔn)品圖譜見圖1。

圖1 敵菌靈標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

1.6 樣品提取溶劑的選擇

根據(jù)化學(xué)性質(zhì)，敵菌靈易溶于甲醇、乙腈、丙酮等多數(shù)有機試劑，在水中幾乎不溶解[1-2]。試驗選取了3種在農(nóng)藥殘留檢測中常用且極性各不相同的提取試劑：乙酸乙酯、丙酮和乙腈。通過在空白基質(zhì)中添加敵菌靈標(biāo)準(zhǔn)品，并使用這3種試劑進(jìn)行提取，測定其樣品回收率。

1.7 凈化固相萃取柱的選擇

凈化是樣品前處理部分的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，選取合適的固相萃取柱能夠有效地去除基質(zhì)中的雜質(zhì)，縮短凈化時間，有效富集被測物，大大提高檢測的靈敏度。方法選擇GCB固相萃取柱及Florisil柱進(jìn)行比對，通過添加敵菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)過固相萃取柱凈化后，測定其回收率，對其進(jìn)行比較。

1.8 凈化固相萃取柱的選擇

于15 mL試管中加入適量的敵菌靈標(biāo)準(zhǔn)工作液，氮吹至近干后，加入3 mL正己烷溶解，渦旋混和均勻，通過預(yù)淋洗完的Florisil柱，分別用5，10，15，20 mL 4種不同用量的正己烷—丙酮溶液(體積比85∶15)進(jìn)行洗脫，同時收集洗脫液，40 ℃條件下氮吹至近干，用1 mL甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾，上機分析。

1.9 基質(zhì)效應(yīng)的評價

吸取適量敵菌靈農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)貯備液，分別使用甲醇及空白樣品處理液進(jìn)行定容，得到相同濃度的工作液后上機測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取溶劑的選擇

提取結(jié)果顯示，乙酸乙酯、丙酮和乙腈3種試劑均能有效提取敵菌靈，回收率分別為95%，92%，97%(均大于80%)，能達(dá)到農(nóng)藥殘留分析的要求[13]。其中使用乙腈提取時，在提取液加入氯化鈉并振蕩離心后能夠與水相有效分離，而丙酮卻難以與基質(zhì)中的水分離，為下一步的凈化工作帶來困難。與此同時，乙腈相較于乙酸乙酯，在樣品中提取出的色素、脂肪、蛋白等雜質(zhì)少，有利于下一步的凈化。綜合考慮，選擇乙腈作為提取試劑。

2.2 凈化固相萃取柱的選擇

通過試驗發(fā)現(xiàn)，GCB柱具有優(yōu)異的色素、雜質(zhì)吸附性能，但對被測物有較強的吸附，且難以洗脫，造成試驗整體回收率偏低，其回收率在70%左右，而相對Florisil柱的回收率達(dá)到95%。故方法選擇色素吸附性能稍弱，但利于被測物洗脫，能夠滿足試驗回收率要求的Florisil固相萃取柱作為凈化用固相萃取柱。

過GCB、Florisil固相萃取柱標(biāo)準(zhǔn)品圖譜見圖2、3。對比圖2～3可知，GCB固相萃取柱和Florisil固相萃取柱都能基本去除基質(zhì)中的干擾雜質(zhì)，但使用GCB柱凈化相對回收率較低，綜合被測物回收率及凈化效果，最終選擇Florisil固相萃取柱為凈化用固相萃取柱。

圖2 過GCB固相萃取柱標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

Figure 2 MRM chromatogram of anilazine through GCB solid phase extraction column

圖3 過Florisil固相萃取柱標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

Figure 3 MRM chromatogram of anilazine through florisil solid phase extraction column

2.3 固相萃取柱洗脫液的選擇

淋洗液與回收率圖譜見圖4。由圖4可知，洗脫液使用量為5 mL時，敵菌靈的回收率僅達(dá)到25%左右，并不能滿足農(nóng)殘分析要求；當(dāng)洗脫液用量提高到15 mL時，幾乎能完全將敵菌靈洗脫，回收率達(dá)到95%；增加使用量至20 mL時，未能顯著提高回收利率，故在綜合成本及效率因素考慮后，方法選擇使用15 mL正己烷—丙酮溶液(體積比85∶15)進(jìn)行洗脫。

圖4 淋洗液與回收率圖譜

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的評價

經(jīng)過上機測定后發(fā)現(xiàn)，在番茄及黃瓜基質(zhì)中敵菌靈的離子化效率較甲醇溶液中低，基質(zhì)效應(yīng)在80%左右，結(jié)果見表3。故在樣品分析時采用相同基質(zhì)內(nèi)添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線校正以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.5 線性關(guān)系與檢出限

以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制敵菌靈標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖3所示，在0.1～10.0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為Y=172.63X-335.62 (R2=0.999 8)。

同時以3倍信噪比，測得敵菌靈方法檢出限為0.01 mg/kg；以10倍信噪比，測得敵菌靈方法定量限為0.03 mg/kg。

圖5 敵菌靈的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.6 準(zhǔn)確度及精密度試驗

采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加法，選取番茄及黃瓜陰性樣品，分別添加0.03，0.10，0.50 mg/kg進(jìn)行回收率試驗，每個添加水平重復(fù)測定6次，測定后得到敵菌靈在番茄及黃瓜基質(zhì)中的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表4。

3 結(jié)論

試驗采用固相萃取前處理，建立了高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定番茄和黃瓜中敵菌靈殘留量的方法，并優(yōu)化了試驗條件，在保證分離度的前提下，采用固相萃取小柱凈化，以C18色譜柱為分離柱，以甲酸水—乙腈為流動相進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)LC-MS/MS檢測，以多反應(yīng)監(jiān)測模式監(jiān)測目標(biāo)化合物的特征離子進(jìn)行定性定量分析。該方法添加回收率在88.3%～95.2%，變異系數(shù)在4.5%～8.8%。試驗證明高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法前處理方法簡單、分離被測物能力強，能準(zhǔn)確定量、定性；能夠節(jié)省分析時間，提高檢測效率。使用試驗方法完全可以滿足番茄和黃瓜中敵菌靈殘留量的日常檢測需求。但由于研究過程中，采用基質(zhì)種類與數(shù)量有限，在葉菜類等類似基質(zhì)樣品中的利用有待進(jìn)一步的探索和研究。

表4 敵菌靈回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差測定結(jié)果