黃赟 李智文 黃晅昱 劉晨

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是具有高侵襲性的惡性腫瘤之一，術(shù)后生存率低，復(fù)發(fā)率高，5年生存率小于20%[1-2]。目前，手術(shù)切除、放療和化療仍是治療肝癌的主要方法。然而在過去的十余年中， HCC患者的生存率仍未見有效提高。因此，開發(fā)新的治療肝HCC的有效藥物具有十分重要的意義。和厚樸酚（honokiol，HNK）是厚樸的主要活性成分之一，具有多種藥理作用，如抗病毒、抗菌、抗炎、抗衰老、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)等作用[3-5]。越來越多研究表明，HNK具有廣泛的抗腫瘤活性作用[6-8]。然而，關(guān)于HNK對HCC的抗腫瘤作用，尤其是涉及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面的研究還很少。在本研究中，我們通過研究HNK對正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞間毒性的差異，以及探討HNK對人肝癌細(xì)胞株Hep3B在體外和體內(nèi)的增殖影響，從而明確HNK是否有抗肝細(xì)胞癌的作用。進(jìn)一步的機(jī)制研究中，我們試圖尋找合適的分子機(jī)制來解釋上述功能變化。本研究探索了HNK在HCC治療中可能的作用機(jī)制，為HNK進(jìn)一步應(yīng)用于肝癌的臨床治療提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

抗細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、p53、p27、p21抗體均購自美國CellSignaling Technology公司?？垢视腿?3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自美國Proteintech公司。細(xì)胞周期檢測試劑盒（流式）購自北京碧云天生物技術(shù)公司。3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）試劑盒和二甲基亞砜購自美國Sigma公司。草酸銨結(jié)晶紫染色液購自北京索萊寶公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

永生化人肝細(xì)胞LO2和人肝癌Hep3B細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞生長至70%左右密度時(shí)先更換為無血清培養(yǎng)基，再給予藥物處理。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物模型建立

4 ～ 5周齡的雌性裸鼠（BALB/C-nu/nu；18 ～ 20 g）由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，均飼養(yǎng)在福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。Hep3B細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型建立方法如下：將Hep3B細(xì)胞調(diào)整密度為2.0×106重懸于100 mL無血清DMEM中并接種在裸鼠的左下腹來構(gòu)建皮下腫瘤模型。注射10天后可觀察到腫瘤時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為2組，每組5只，治療組每日腹腔注射50 mg/kg 和厚樸酚，對照組為相同體積的溶劑腹腔注射，持續(xù)3周。3周后處死并收集腫瘤，并在固定前測量腫瘤重量和體積。腫瘤體積計(jì)算方法：測量長徑a（cm）和短徑b（cm），腫瘤體積V （cm3）=a×b2/2。

1.4 細(xì)胞存活率及增殖能力檢測

采用MTT法測試Hep3B細(xì)胞的存活率和增殖情況。將細(xì)胞以特定密度（1 500個(gè)細(xì)胞/孔用于測定增殖活力；5 000個(gè)細(xì)胞/孔用于測定存活率）植入96孔板中并培養(yǎng)1 ～ 2天。在HNK刺激后，在每個(gè)孔中加入20 μL MTT（5 mg / mL）。孵育4小時(shí)后，除去含有MTT的培養(yǎng)基，并向每個(gè)孔中加入150 μL 二甲基亞砜。在490 nm波長下測量每個(gè)孔的光密度值（OD）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)使用10個(gè)復(fù)孔。

1.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞以200個(gè)/孔的密度種植于6孔培養(yǎng)板上。培養(yǎng)14天后，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，并用2.0%結(jié)晶紫（購自中國北京Solarbio公司）染色。使用顯微鏡對細(xì)胞克隆團(tuán)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并確保每個(gè)細(xì)胞團(tuán)均含有50個(gè)以上細(xì)胞。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期

使用細(xì)胞周期檢測試劑盒進(jìn)行細(xì)胞周期分析。收集培養(yǎng)的細(xì)胞，消化后固定于70%冰冷乙醇中，并在4℃下儲(chǔ)存過夜。之后通過離心（1 000×g，5分鐘）除去乙醇，然后用熒光染料碘化丙啶（PI）和RNase A在37℃、避光條件下染色30分鐘。最后使用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期。

1.7 Western blot法檢測蛋白水平

4℃條件下在細(xì)胞中加入蛋白裂解液，30分鐘后收集細(xì)胞裂解液，超聲碎裂細(xì)胞，離心（12 000×g，4℃，15分鐘）后測定蛋白濃度，剩余樣品混合上樣緩沖液并置于100℃中變性5分鐘。配置10% 的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，分離蛋白后轉(zhuǎn)移PVDF膜上，用相應(yīng)一抗進(jìn)行孵育（GAPDH稀釋濃度為1:2 000，其余抗體均為1:1 000），TBST洗滌后用相應(yīng)二抗孵育，化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影并進(jìn)行灰度測定及統(tǒng)計(jì)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均采用（表示。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HNK對Hep3B及LO2細(xì)胞活力的影響

我們將兩種細(xì)胞置于不同濃度HNK或不同刺激時(shí)間下進(jìn)行培養(yǎng)，并使用MTT測定法觀察兩種細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，HNK對Hep3B細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性，且有明顯的時(shí)間-濃度依賴性，50%抑制濃度（IC50）為（22.9±3.4）μM（見圖1）。然而，在相同濃度或者時(shí)間的HNK刺激下，永生化人肝細(xì)胞LO2的存活率沒有受到顯著影響（IC50＞40 μM）。該結(jié)果表明HNK對HCC細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒作用。

2.2 HNK在體外實(shí)驗(yàn)中對Hep3B細(xì)胞增殖能力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)（見圖2A）顯示隨著HNK刺激濃度的增加，Hep3B細(xì)胞增殖曲線逐漸趨于平緩，表明HNK降低了Hep3B細(xì)胞的增殖速度具有濃度依賴性。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)（見圖2B）結(jié)果顯示隨著HNK刺激濃度的增加，細(xì)胞聚落形成數(shù)量成顯著下降（0 μM：（54.0±6.8）個(gè)；20 μM：（18.0±2.4）個(gè)；30 μM ：（5.0±1.7）個(gè)；0 μM：20 μM，P=0.016；0 μM：30 μM， P=0.009；20 μM：30 μM，P=0.034）。

2.3 HNK對Hep3B細(xì)胞周期的影響

與對照組相比，HNK治療組（30 μM，24 h）中處于G1期細(xì)胞數(shù)目升高[（51.4±2.21）% vs.（62.2±3.74）%，P=0.023]，處于S期細(xì)胞數(shù)目下降[（32.4±1.81）% vs.（24.2±1.54）%，P=0.026]，Hep3B細(xì)胞從G1期向S期的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化受到抑制（見圖3 ）。

2.3 HNK在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對 Hep3B細(xì)胞增殖能力的影響

使用H e p 3 B 細(xì)胞系和裸鼠構(gòu)建了皮下成瘤模型。與對照組相比，H N K 治療組的腫瘤體積[（0.8 6±0.3 2）vs.（0.41±0.14）cm3，P=0.012]和腫瘤重量[（0.85±0.24）vs.（0.43±0.16）g，P=0.007]均低于對照組（見圖4）。

圖1 HNK 對細(xì)胞活力的影響

圖2 HNK 對Hep3B 細(xì)胞增殖能力的影響

圖3 HNK 誘導(dǎo)Hep3B 細(xì)胞G1/S 期細(xì)胞周期阻滯

圖4 HNK 對Hep3B 細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響

表1 cyclin D1、P53、P27 和P21 蛋白的相對表達(dá)量，n=3）

表1 cyclin D1、P53、P27 和P21 蛋白的相對表達(dá)量，n=3）

注：與0 μM HNK 治療組比較，*P ＜0．05；與20 μM HNK 治療組比較，#P ＜0．05

2.4 HNK處理對細(xì)胞周期蛋白cyclin D1、P53、P27、P21的影響

如圖5和表1所示：在HNK刺激24小時(shí)后，Hep3B中細(xì)胞周期蛋白cyclin D1表達(dá)水平下調(diào)，并呈現(xiàn)出劑量依賴性。同時(shí)， HNK處理后， Hep3B中細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白P53、P27、P21的表達(dá)水平上調(diào)。

圖5 cyclin D1、P53、P27 和P21 蛋白的Western blot 結(jié)果

3 討論

中草藥活性成分用于預(yù)防和治療癌癥已有數(shù)百年歷史，多種植物化學(xué)物質(zhì)如生物堿、黃酮類、多酚化合物等均具有很大的抗癌潛力[9-10]。和厚樸酚（honokiol，HNK）是傳統(tǒng)中草藥厚樸的有效提取物之一，其抗腫瘤活性已在肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤中得到驗(yàn)證[11-13]。

本研究表明，HNK能夠在體外抑制HCC細(xì)胞Hep3B的增殖能力，這種抑制作用與誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S阻滯有關(guān)，這與既往的相關(guān)研究結(jié)果一致[14]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證HNK對于HCC的治療作用，我們構(gòu)建了裸鼠皮下成瘤模型。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，結(jié)果均證實(shí)了HNK對HCC的增殖具有一定的抑制作用。

細(xì)胞周期調(diào)控涉及多種信號(hào)級聯(lián)傳導(dǎo)機(jī)制，包括DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂和增殖等[15]。對G1期、S期、G2期等關(guān)鍵“檢查點(diǎn)”的干擾將導(dǎo)致癌細(xì)胞的分裂失控和過度增殖[16]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CDKIS）的失衡在其中起著關(guān)鍵作用[17]。細(xì)胞周期蛋白D1是細(xì)胞周期蛋白家族的一員，它可以與CDK4或CDK6形成復(fù)合物，用于調(diào)節(jié)細(xì)胞周期從G1向S期的轉(zhuǎn)變[18]。已證實(shí)，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中均存在細(xì)胞周期蛋白D1的過度表達(dá)并伴隨CDK活性的失調(diào)，由此引發(fā)的腫瘤細(xì)胞異常增殖[19]。由于HNK可以影響Hep3B細(xì)胞的細(xì)胞周期并抑制細(xì)胞周期從G1向S期的轉(zhuǎn)變，我們推測HNK可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)來抑制Hep3B細(xì)胞的增殖。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NHK治療可以顯著下調(diào)Hep3B細(xì)胞周期蛋白cyclin D1，上調(diào)CDK抑制蛋白p21和p27。同時(shí)，HNK治療后腫瘤抑制蛋白p53的表達(dá)明顯增加，而P53已被證實(shí)與細(xì)胞周期停滯有關(guān)[20]。總之，本研究證實(shí)了NHK可能是一種天然的細(xì)胞周期蛋白cyclin D1抑制劑，其通過誘導(dǎo)G1/S期阻滯來抑制肝細(xì)胞癌的發(fā)生。

綜上，我們得出結(jié)論：NHK通過抑制細(xì)胞周期蛋白cyclin D1誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S阻滯，進(jìn)而抑制了Hep3B細(xì)胞在體內(nèi)和體外的增殖。因此，HNK可能作為一種天然、安全、有效的肝細(xì)胞癌輔助治療藥物。