呂 昕 王紅艷, 張 斌

世界范圍內(nèi)平均每1 000個新生兒中有9個先天性心臟病(CHD)患兒[1]。CHD也是中國最常見的出生缺陷疾病之一，根據(jù)《中國出生缺陷防治報(bào)告(2012年)》，2011年CHD在中國的發(fā)生率為4.1%。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是心臟發(fā)育中一個重要環(huán)節(jié)，其對心臟瓣膜的形成、心臟心房和心室的間隔、心肌的生長和冠狀動脈血管的形成均非常重要[2]。例如，心內(nèi)膜細(xì)胞的EMT過程產(chǎn)生心臟瓣膜前體細(xì)胞，參與瓣膜的形成[3-5];心外膜細(xì)胞通過EMT過程，參與心肌細(xì)胞譜系的發(fā)生，參與心肌生長、冠狀動脈血管生成以及心臟間質(zhì)細(xì)胞的生成[6-8]。

轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)信號通路在心臟發(fā)育的EMT過程中起著重要作用[9-11]。TGF-β有TGFBR1、TGFBR2和TGFBR3共3個受體。TGFBR3又稱β-glycan。TGFBR3可通過胞內(nèi)域與TGFBR1或TGFBR2形成蛋白復(fù)合物，抑制TGF-β信號通路活性[12]。TGFBR3胞外域包含兩個與TGF-β配體具有很高的親和性的結(jié)合域[13-15]。TGFBR3胞外域可以被細(xì)胞膜表面的蛋白酶切割釋放到基質(zhì)與基質(zhì)中的TGF-β結(jié)合，從而減少TGF-β與TGFBR1/2的結(jié)合，拮抗TGF-β的作用[16]。TGFBR3是參與心臟發(fā)育和先天性心臟病發(fā)生的重要基因。TGFBR3純合敲除小鼠在胚胎期13.5 d時(shí)呈現(xiàn)冠狀動脈血管發(fā)育異常，在胚胎期14 d時(shí)冠狀動脈血管形成失敗，最終在14.5 d時(shí)小鼠死亡，這一時(shí)間正是有功能的冠狀動脈血管對心臟發(fā)育和胚胎發(fā)育起作用的時(shí)間[17]。但是，目前關(guān)于TGFBR3在人類CHD中的作用尚未見報(bào)道。本研究旨在尋找CHD疾病特異性的TGFBR3基因突變位點(diǎn)，并初步驗(yàn)證其對基因功能的影響。

1 方法

1.1 倫理 本研究經(jīng)過復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)[倫研批第(216)號]。研究對象的臨床信息及血液樣本采集均獲得父母或監(jiān)護(hù)人的書面知情同意，并嚴(yán)格遵守赫爾辛基宣言的各項(xiàng)規(guī)定。

1.2 研究對象 本研究病例組CHD患兒和對照組健康兒童的來源、CHD的亞型分類同文獻(xiàn)[18]。

1.3 DNA測序和生物信息學(xué)分析 病例組和對照組外周靜脈血基因組DNA的抽提方法以及TGFBR3基因的編碼區(qū)靶向測序方法和測序公司等與文獻(xiàn)[18]相同。測序結(jié)果參考hg19/GRCh37(NM_001202)版本對單核苷酸變異(SNV)進(jìn)行注釋，并經(jīng)基因組進(jìn)化速率評測(GERP)分析位點(diǎn)的保守性[19, 20]。篩選得到CHD特異突變后，應(yīng)用以下3個公共數(shù)據(jù)庫檢測突變頻率：千人基因組(1KG，http://www.1000genomes.org)，the Exome Aggregation Consortium(ExAC, http://exac.broad-institute.org)和GnomAD (http://gnomad.broadinstitute.org)。再使用Sanger測序方法對相應(yīng)樣本的突變位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。突變有害性預(yù)測使用SIFT[21](http://sift.jcvi.org/)和PolyPhen-2[22](http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/)軟件。TGFBR3蛋白保守性分析參考UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/align/A)。

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建和點(diǎn)突變 從HEK293T細(xì)胞(中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫)中提取總RNA(中國天根生化科技有限公司總RNA提取試劑盒)，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA(中國天根生化科技有限公司FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒)，再經(jīng)PCR反應(yīng)(擴(kuò)增引物序列見表1引物1)擴(kuò)增得到野生型TGFBR3編碼序列，克隆到pGEM-T-Easy載體上(美國Promega公司)，并通過PCR的方法定點(diǎn)突變獲得突變型TGFBR3(點(diǎn)突變引物序列見表1引物2～4)。分別將野生型和突變型TGFBR3編碼序列克隆至pCMV6-AC-GFP(美國Origene公司)表達(dá)載體。

表1 擴(kuò)增引物序列

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HEK293T細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM(美國Gibico)在5% CO2，37℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。使用Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Thermofisher公司)，遵照Lipo2000使用手冊進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.6 Western-blot實(shí)驗(yàn) HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型或突變型TGFBR3表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后24 h收取細(xì)胞，使用RIPA試劑裂解細(xì)胞。細(xì)胞總蛋白上樣，經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)和顯影，然后使用ImageJ軟件對顯影結(jié)果進(jìn)行灰度分析，計(jì)算并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。免疫反應(yīng)抗體anti-tGFP(美國Origene公司，1∶3 000稀釋)，anti-ACTIN(美國Origene公司，1∶5 000稀釋)，羊抗鼠二抗[艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司，1∶10 000稀釋]，具體實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[18]。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 在24孔板培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，長至60%密度，使用Lipo2000分別共轉(zhuǎn)染等量的(300 ng)的野生型或突變型TGFBR3表達(dá)質(zhì)?；虿坏攘?設(shè)置梯度：100 ng, 150 ng, 200 ng, 250 ng, 300 ng)的野生型或突變型TGFBR3表達(dá)質(zhì)粒以及200 ng TGF-β信號通路報(bào)告基因質(zhì)粒pGMSMAD-Lu(吉滿生物科技(上海)有限公司)和10 ng內(nèi)參Rellina基因pRL-TK質(zhì)粒(美國Promega公司)。轉(zhuǎn)染后24 h，使用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(美國Promega公司)檢測熒光素酶活性，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算結(jié)果。

1.8 無血清條件下雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血清影響最終的熒光素酶檢測結(jié)果。在24孔板培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，長至60%密度時(shí)換液，即將舊的含血清培養(yǎng)基換成新的無血清的DMEM培養(yǎng)基，然后開始進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。使用Lipo2000分別共轉(zhuǎn)染300 ng的野生型或突變型TGFBR3表達(dá)質(zhì)粒以及200 ng TGF-β信號通路報(bào)告基因質(zhì)粒pGMSMAD-Lu(吉滿生物科技(上海)有限公司)，10 ng內(nèi)參Rellina基因pRL-TK質(zhì)粒(美國Promega公司)，其他同1.7。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用Image J軟件進(jìn)行灰度分析?；叶确治鼋Y(jié)果以及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果都采用雙尾非配對t檢驗(yàn)分析顯著性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 本研究病例組404例，對照組213名，病例組年齡(2.9±2.7)歲，對照組年齡(7.1±3.7)歲；病例組和對照組的男女比例分別為1.2∶1和1∶1。CHD的亞型分類同文獻(xiàn)[8]。

2.2TGFBR3基因新發(fā)現(xiàn)/稀有突變的鑒定TGFBR3基因外顯子的深度靶向測序分析發(fā)現(xiàn)3個獨(dú)立存在的CHD特有的突變：TGFBR3c.2054A>G(p.K685R)、TGFBR3c.2372C>T(p.A791V)和TGFBR3 c.2410G>T(p.A804S)，以下分別簡稱為TGFBR3K685、TGFBR3A791V和TGFBR3A804S。Sanger測序進(jìn)一步驗(yàn)證顯示這3個突變均為雜合突變(圖1A)。與千人基因組(1KG)，ExAC和GnomAD等數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)比較結(jié)果顯示：TGFBR3K685R在三個數(shù)據(jù)庫中均未有報(bào)道，屬于新發(fā)突變，而TGFBR3A791V和TGFBR3A804S是在亞洲人群中未有報(bào)道的稀有突變(GnomAD數(shù)據(jù)庫中在總?cè)巳褐型蛔冾l率分別為3.18×10-5和7.96×10-6)，并且被預(yù)測為有害突變(表2)。突變TGFBR3K685R位于蛋白胞外Zona Pellucida結(jié)構(gòu)域(ZP domain)，突變TGFBR3A791V和TGFBR3A804S位于跨膜結(jié)構(gòu)上(圖1B)。3個突變處編碼對應(yīng)的氨基酸在脊椎動物中高度保守(圖1C)。

表2 攜帶TGFBR3稀有錯義突變患者的基因型與臨床信息

注 GERP：基因組進(jìn)化速率評測，1 KG：千人基因組數(shù)據(jù)庫，GenomAD：基因組聚集數(shù)據(jù)庫，ASD：房間隔缺損，TOF：法洛四聯(lián)癥，DORV：右心室雙出口，PH：肺動脈高壓，NA：無數(shù)據(jù)

圖1 先天性心臟病特異的新發(fā)現(xiàn)/稀有的TGFBR3錯義突變

注 A：3個突變的一代測序結(jié)果圖，箭頭分別指示突變的位置；B：TGFBR3蛋白結(jié)構(gòu)示意圖，箭頭分別指示3個突變在蛋白上的位置；C：人和其他部分脊椎動物TGFBR3氨基酸序列的部分比對，紅框表示突變氨基酸的位置

2.3 突變TGFBR3K685R和TGFBR3A804S導(dǎo)致TGFBR3蛋白表達(dá)水平下降 Western Blot結(jié)果(圖2A)顯示，與野生型TGFBR3蛋白相比較，突變TGFBR3K685R和TGFBR3A804S的蛋白水平顯著下降，而突變TGFBR3A791V的蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 突變TGFBR3K685R、TGFBR3A791V和TGFBR3A804S導(dǎo)致TGFBR3對TGF-β信號通路的抑制作用降低。

2.4.1 圖2B顯示，HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染等量突變型和野生型TGFBR3過表達(dá)質(zhì)粒，相比空載對照組，野生型TGFBR3對TGF-β信號通路的應(yīng)答有顯著的抑制作用，突變TGFBR3A791V和TGFBR3A804S對TGF-β信號通路的抑制作用與野生型TGFBR3相似，但是突變TGFBR3K685R則部分喪失了對TGF-β信號通路的抑制作用。

2.4.2 圖2C顯示，為了排除細(xì)胞培養(yǎng)基中胎牛血清對實(shí)驗(yàn)的干擾，在轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞前用無血清培養(yǎng)基替換含有血清的培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)染等量的野生型和突變型過表達(dá)質(zhì)粒，與野生型TGFBR3比較，3種突變蛋白TGFBR3K685R，TGFBR3A791V和TGFBR3A804S對TGF-β信號通路的抑制作用均顯著降低。

2.4.3 圖2D顯示，通過調(diào)節(jié)突變型TGFBR3表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染量，使被轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞中表達(dá)的突變型和野生型TGFBR3蛋白水平相似，這時(shí)與空載對照組比較，野生型TGFBR3對TGF-β信號通路有顯著抑制作用，突變TGFBR3A791V和TGFBR3A804S對TGF-β信號通路的抑制作用與野生型TGFBR3相似，而突變TGFBR3K685R對TGF-β信號通路的抑制作用還是顯著降低。

圖2TGFBR3點(diǎn)突變對TGFBR3蛋白表達(dá)以及對TGF-β信號通路的影響

注 A：用2.5 μg野生型或突變型TGFBR3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的HEK293T細(xì)胞TGFBR3蛋白的免疫印跡以及灰度分析。B：在正常培養(yǎng)基(10%FBS)培養(yǎng)條件下，等量的野生型或突變型TGFBR3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后HEK293T細(xì)胞的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。C：在無血清培養(yǎng)基條件下，等量的野生型或突變型TGFBR3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后HEK293T細(xì)胞的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。D：野生型/突變型TGFBR3蛋白表達(dá)相同時(shí)，在正常培養(yǎng)基(10%FBS)培養(yǎng)條件下HEK293T細(xì)胞的熒光素酶報(bào)告基因的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果和TGFBR3蛋白的免疫印跡。柱形圖為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，顯示了平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。1)：P<0.05;2)：P<0.01；3)：差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3 討論

本研究通過中國山東地區(qū)漢族404例CHD樣本以及213例對照樣本的TGFBR3基因外顯子靶向測序，發(fā)現(xiàn)1個疾病特異的新發(fā)雜合突變(TGFBR3K685R)和2個疾病特異的稀有雜合突變(TGFBR3A791V和TGFBR3A804S)。本文體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還顯示，突變TGFBR3K685R在有或無血清條件下都顯著降低了TGFBR3對TGF-β信號通路的抑制作用，而TGFBR3A791V和TGFBR3A804S則只在無血清條件下對TGF-β信號通路的抑制作用顯著降低。研究第一次揭示TGFBR3基因來自CHD患兒的稀有突變可能因?yàn)楦蓴_TGF-β信號通路的功能參與CHD的發(fā)生。

基于小鼠TGFBR3是小鼠心臟發(fā)育不可缺少的重要基因的事實(shí)，本研究假設(shè)人TGFBR3基因的突變也與人CHD有關(guān)。本研究通過對中國山東漢族人群404例CHD樣品和213例健康對照樣品TGFBR3基因進(jìn)行外顯子靶向測序和生信分析，發(fā)現(xiàn)/驗(yàn)證了3個疾病特異性的新發(fā)/稀有突變：TGFBR3K685R，TGFBR3A791V和TGFBR3A804S。我們對突變蛋白的功能研究實(shí)驗(yàn)顯示突變蛋白TGFBR3K685R和TGFBR3A804S表達(dá)水平顯著下降。我們還發(fā)現(xiàn)這TGFBR3基因三個突變都顯著減弱了對TGF-β信號通路的抑制作用。因此，我們的研究結(jié)果表明在先天性心臟病例發(fā)現(xiàn)的TGFBR3稀有突變也許與CHD的發(fā)生有關(guān)。

TGFBR3的胞外域能被切割下來形成可溶的sTGFBR3，通過競爭性結(jié)合TGF-β配體，抑制TGF-β與TGF-β通路核心受體TGFBR2結(jié)合，從而達(dá)到抑制通路信號傳導(dǎo)的作用。同時(shí)TGFBR3胞內(nèi)域與TGFBR2-配體復(fù)合物的結(jié)合(識別GIPC結(jié)構(gòu))，也會競爭性抑制TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[12, 23, 24]。TGFBR3K685R突變位于胞外ZP結(jié)構(gòu)域上，同時(shí)也位于TGFBR3蛋白的第二個TGF-β配體的結(jié)合域。因此TGFBR3K685R突變蛋白可能有3種方式降低對TGF-β信號通路的抑制作用：①TGFBR3K685R突變導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平顯著下降，胞外被切割的sTGFBR3總量也減少，因而競爭性結(jié)合TGF-β配體的能力降低；②TGFBR3K685R蛋白表達(dá)水平顯著下降使得能與TGFBR2結(jié)合的TGFBR3胞內(nèi)域總量減少，因而對TGFBR2抑制作用減少；③TGFBR3K685R突變氨基酸可能導(dǎo)致sTGFBR3與配體結(jié)合能力下降，從而有更多TGF-β配體與TGFBR2結(jié)合激活TGF-β信號通路。TGFBR3A791V和TGFBR3A804S突變氨基酸都位于TGFBR3蛋白的穿膜結(jié)構(gòu)域，因此猜測這2個突變氨基酸可能改變了TGFBR3蛋白空間三維結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致TGFBR3上膜能力降低或者胞外域被切割能力降低，使得sTGFBR3濃度降低。從CHD病例發(fā)現(xiàn)的3個TGFBR3突變抑制TGF-β信號通路的能力降低的分子機(jī)制值得進(jìn)一步的深入研究。

結(jié)論：TGFBR3K685R、TGFBR3A791V和TGFBR3A804S3個突變可能是導(dǎo)致CHD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素。