馬文靜,魏小紅,宿梅飛,駱巧娟,趙 穎

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 蘭州 730070

紫花苜蓿(Medicagosativa)是一種重要的牧草品種,營養(yǎng)品質(zhì)高,產(chǎn)量高[1]。全世界的苜蓿種植面積約3.22×107hm2,我國苜蓿種植面積約3.77×106hm2,居各類人工草地之首,而紫花苜蓿是全世界栽培利用最為廣泛的牧草[2]。紫花苜蓿發(fā)達(dá)的根系可有效防止水土流失[3];此外,作為一種豆科植物,紫花苜蓿通過根系與根瘤菌建立共生關(guān)系,能夠?qū)⒌潭ㄔ诟鲋械南跛猁}上,使其成為可持續(xù)農(nóng)業(yè)的理想作物[4]。但是長期以來,干旱一直是限制紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素,因干旱脅迫導(dǎo)致紫花苜蓿產(chǎn)量和質(zhì)量下降的同時,限制了畜牧業(yè)規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化發(fā)展。尤其是苗期較敏感,對水分的需求量較大,干旱脅迫會嚴(yán)重影響紫花苜蓿幼苗的生長發(fā)育。因此,深入紫花苜蓿幼苗的抗旱性研究,是提高西北干旱半干旱地區(qū)紫花苜蓿人工草地產(chǎn)量、節(jié)約灌溉的根本途徑之一,對紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(non-structure carbohydrate, NSC)是植物光合作用的產(chǎn)物,也是呼吸作用的底物,主要由淀粉、果糖、葡萄糖和蔗糖等水溶性糖組成[5]。其含量的大小是植物體內(nèi)表征碳收支狀況的能源指標(biāo),也反映了可供植物存活和生長的物質(zhì)水平[6-7]。非碳水化合物是植物生長發(fā)育過程中的重要能量提供者,同時在植物抗逆過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,其儲存和轉(zhuǎn)移對植物響應(yīng)環(huán)境脅迫過程起關(guān)鍵作用[8-9]。研究表明植物可以通過調(diào)控不同器官的碳分配來應(yīng)對水分條件的變化,決定其存活與生長[10]。王凱等對干旱致死過程中沙地樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)幼苗非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的變化的研究有力的證明該觀點(diǎn)[11]。雷虹等在小葉錦雞兒(Caraganamicrophylla)幼苗非結(jié)構(gòu)性碳水化合物積累及分配對干旱脅迫的響應(yīng)的研究中進(jìn)一步證明非碳水化合物的積累量也是植物應(yīng)對干旱脅迫的重要因素[12]。研究發(fā)現(xiàn),白羊草(Bothriochloaischaemum(L.) Keng.)可以提高其淀粉和可溶性糖的含量來應(yīng)對不同程度的干旱脅迫[13]。郭瑞盼等發(fā)現(xiàn)溶性總糖、果糖、淀粉和果聚糖的水解對提高小麥(TriticumaestivumL．)抗旱性有重要作用[14]?？傊?非結(jié)構(gòu)性碳水化合物代謝在植物抗旱中的作用不容忽視,研究其含量及分配的變化對研究植物的抗旱機(jī)制具有重要的意義。目前逆境下紫花苜蓿的研究主要集中在蛋白質(zhì)方面,孰不知糖是蛋白質(zhì)合成的碳源,其分解得到的能量也被用于蛋白質(zhì)的合成,紫花苜蓿非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的合成與分解對蛋白質(zhì)的代謝至關(guān)重要。

NO(nitric oxide, NO)是一種廣泛存在于生物體內(nèi),并可以在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間傳遞信息的信使分子[15]。植物體內(nèi)NO的合成主要依賴于一氧化氮合酶(NOS)和硝酸還原酶(NR)途徑[16]。NO參與誘導(dǎo)植物抗逆,如植物的抗鹽、抗熱、抗寒、抗病和應(yīng)對重金屬脅迫等。研究發(fā)現(xiàn)NO在植物的抗旱性中發(fā)揮著不可替代的作用,NO可以調(diào)節(jié)植物的氣孔關(guān)閉、離子吸收速率、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量、抗氧化酶活性等來增強(qiáng)其抗旱性[17-19]。因此,NO通過影響植物在逆境條件下的耐受閾值來增強(qiáng)植物的抗逆性。carboxy-PTIO(cPTIO),是一種常用的一氧化氮清除劑,可以用于抑制一氧化氮信號通路。carboxy-PTIO與NO反應(yīng)生成carboxy-PTIO衍生物,同時產(chǎn)生亞硝酸鹽或硝酸鹽,從而起到清除NO的作用。NO抑制劑cPTIO則能夠顯著降低植物葉片的NO含量,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于揭示NO在植物抗逆中的功能[20-21]。

盡管NO在植物抗旱方面的研究已經(jīng)非常廣泛,但是NO對紫花苜蓿非結(jié)構(gòu)碳水化合物代謝的調(diào)控尚不清楚。因此本試驗以紫花苜蓿幼苗為材料,通過分析干旱脅迫下NO對紫花苜蓿葉片、根系中非結(jié)構(gòu)碳水化合物含量及其相關(guān)代謝酶活性的動態(tài)變化,進(jìn)一步明確NO提高紫花苜?？购敌缘淖饔脵C(jī)制,為紫花苜蓿在西北干旱半干旱地區(qū)的推廣種植提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理

試驗于2017年9月—2018年6月在生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生理實(shí)驗室進(jìn)行,供試紫花苜蓿品種‘三得利’(Medicagosativa‘Sandili’)購于甘肅農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子公司。

選取顆粒飽滿、無病蟲害的紫花苜蓿種子進(jìn)行消毒處理,然后用蒸餾水清洗,浸種催芽后選取露白一致的種子,均勻點(diǎn)播于裝有高壓滅菌營養(yǎng)土的的花盆(φ=12 cm)中,每盆70粒,再覆蓋上0.5 cm厚的蛭石,輕輕壓實(shí),蛭石表面噴灑20 mL蒸餾水,在(25±1)℃下, 12 h光照/12 h黑暗,光強(qiáng)6000 lx進(jìn)行培養(yǎng),每隔2天使用稱重法補(bǔ)充水分,培養(yǎng)45 d后每盆保留30株生長一致且健康的紫花苜蓿植株,此時的植株處于營養(yǎng)生長階段。分別量取5 mL蒸餾水、0.1 mmol/L SNP(NO釋放劑)、200 μmol/L cPTIO處理液噴施于不同組合的葉面(SNP及cPTIO處理液中加入附著劑tween20),每天進(jìn)行噴施。同時在干旱處理組土壤中澆50 mL 10% PEG-6000進(jìn)行滲透脅迫處理,每2天澆一次,連續(xù)處理8 d,正常澆水處理組加等量蒸餾水。處理設(shè)置：蒸餾水(CK);0.1 mmol/L SNP;10%PEG; 10%PEG+ 0.1 mmol/L SNP;200 μmol/L cPTIO;10%PEG+200 μmol/L cPTIO,每組處理重復(fù)3次。分別于1、3、5、7 d采集葉片和根系,分為兩份,一份烘干保存用于非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的測定,另一份立即放置于液氮中快速冷凍,并在-20℃保存用于非結(jié)構(gòu)性碳水化合物相關(guān)酶活性的測定。

1.2 測試項目及方法

淀粉含量采用蒽酮比色法[22]測定。蔗糖和果糖含量采用間苯二酚比色法[23-24]測定。葡萄糖含量參考姜慧新等的方法并略作修改[25-26]。蔗糖合成酶(Sucrose synthetase,SS)和蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate synthase,SPS)的提取與測定參照田紅梅和董彥紅的方法[27-28],并略加修改。酸性轉(zhuǎn)化酶(Acid invertase,AI)、中性轉(zhuǎn)化酶(Neatral invertase,NI)的測定采用3,5-二硝基水楊酸法,通過測定還原糖的生成量表示其活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2013進(jìn)行處理及作圖,用SPSS 21.0軟件Duncan法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,圖中字母不同表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 NO對干旱脅迫下對紫花苜蓿幼苗非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量的影響

2.1.1NO對干旱脅迫下對紫花苜蓿葉片、根系中淀粉含量的影響

圖1 NO對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片、根系淀粉含量變化的影響Fig.1 Effects of nitric oxide on starch content of alfalfa seedings leaf and root under drought stress 相同處理天數(shù)不同字母表示差異顯著(P<0.05);CK： (對照，control check) SNP ：(硝普鈉，Sodium nitroprusside);PEG：(聚乙二醇，Polyethylene glycol)PEG+ SNP：(聚乙二醇+硝普鈉，Polyethylene glycol+ Sodium nitroprusside);cPTIO：(NO清除劑，carboxy-PTIO)PEG+ cPTIO：(聚乙二醇+NO清除劑，Polyethylene glycol+ carboxy-PTIO)

如圖1所示,隨干旱脅迫時間的延長,紫花苜蓿葉片中淀粉含量呈逐漸下降的趨勢。第3天,與CK相比,PEG、cPTIO處理淀粉含量分別降低6.34%、13.27%,PEG+SNP、PEG+cPTIO處理比PEG分別降低了24.91、13.97%。第7天,與CK相比,PEG、 PEG+SNP處理淀粉含量降低了29.45%、44.76%。在整個處理過程中,SNP處理下紫花苜蓿葉片中淀粉含量升高,cPTIO、PEG+cPTIO處理后期沒有顯著變化。

由圖1可知,隨干旱脅迫時間的延長,紫花苜蓿根中淀粉含量逐漸增加。在第7天時各處理差異顯著(P<0.05),PEG、SNP和PEG+SNP處理下根中淀粉含量達(dá)到最大值, SNP、PEG處理淀粉含量分別比CK提高了49.25%、 36.51%, PEG+SNP處理比PEG提高了20.01%。不論水分條件如何,cPTIO處理下淀粉含量先升高后下降,在第3天達(dá)到最大值,cPTIO、PEG+cPTIO處理淀粉含量分別比CK提高了56.4%、68.63%,在第7天,分別降低了19.27%、33.10%。

2.1.2NO對干旱脅迫下對紫花苜蓿葉片、根系中蔗糖含量的影響

如圖2所示,隨著干旱脅迫時間的延長,紫花苜蓿葉片蔗糖含量呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢。第3天,PEG、cPTIO處理分別比CK提高了73.79%、78.50%,PEG+cPTIO處理比PEG提高了17.58%。第5天,SNP、PEG和PEG+SNP處理達(dá)到最大值, SNP、PEG分別比CK提高了22.61%、69.05%,PEG+SNP處理比PEG提高了21.43%。第7天, PEG、PEG+SNP和PEG+cPTIO處理下蔗糖含量分別比對照提高了42.04%、90.25%和27.84%,而cPTIO處理則比CK顯著下降了12.35%。

如圖2所示,隨著干旱脅迫時間的延長,紫花苜蓿根系中蔗糖含量呈先升高后下降的變化趨勢,第5天達(dá)到最大值。第5天,SNP、PEG處理蔗糖含量分別比CK顯著提高了66.98%、39.90%(P<0.05),PEG+SNP處理比PEG處理提高了30.42%。不論水分條件如何,cPTIO處理下蔗糖含量呈先升高后下降的變化趨勢,在第3天達(dá)到最大值,cPTIO、PEG+cPTIO處理蔗糖含量分別比CK提高了51.96%、23.32%,在第7天,顯著降低了37.70%、43.79%。

圖2 NO對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片、根系蔗糖含量變化的影響Fig.2 Effects of nitric oxide on sucrose content of alfalfa seeding leaf and root under drought stress

2.1.3NO對干旱脅迫下對紫花苜蓿葉片、根系中果糖含量的影響

由圖3可知,隨干旱脅迫時間的延長,紫花苜蓿葉片中果糖含量呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢,并在第5天達(dá)到最大值,PEG+SNP處理比PEG提高了10.47%。在第7天,PEG+cPTIO處理與PEG相比顯著降低了43.92%(P<0.05)。在正常澆水下,噴施SNP使葉片中果糖含量逐漸上升,并在第7天達(dá)最大值;在第7天時,cPTIO處理使果糖含量比CK降低了44.29%。

由圖3可知,干旱脅迫使紫花苜蓿根系中果糖含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,在第3天達(dá)最大值。第5天,PEG+SNP比單獨(dú)脅迫處理提高了55.83%。第7天,PEG+cPTIO處理果糖含量比PEG下降了30.62%。在正常澆水下,第7天時,與CK相比,SNP處理下果糖含量提高了57.85%,cPTIO處理下降了27.06%。

圖3 NO對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片、根系果糖含量變化的影響Fig.3 Effects of nitric oxide on fructose content of alfalfa seeding leaf and root under drought stress

2.1.4NO對干旱脅迫下對紫花苜蓿葉片、根系中葡萄糖含量的影響

如圖4所示,隨干旱脅迫時間的延長,紫花苜蓿葉片中葡萄糖含量呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢,并在第5天達(dá)到最大值。第1天,cPTIO處理比CK降低了31.33%。第5天時,SNP、PEG、PEG+SNP和PEG+cPTIO處理下葡萄糖的含量分別比CK顯著提高了34.56%、87.56%、91.7%和78.8%(P<0.05)。第7天,SNP處理葡萄糖含量比CK提高了35.83%,PEG+SNP處理比PEG 提高了46.15%,PEG+cPTIO處理比PEG降低了11.42%,cPTIO處理比CK下降了35.83%。

如圖4所示,隨干旱脅迫時間的延長,紫花苜蓿根系中葡萄糖含量的變化趨勢與葉片中相同,第3天達(dá)到最大值,SNP、PEG、PEG+SNP和PEG+cPTIO處理葡萄糖的含量分別比CK提高了52.30%、39.63%、58.29%和15.44%,cPTIO處理下沒有顯著變化(P<0.05)。第7天,干旱脅迫下的各處理葡萄糖含量顯著下降(P<0.05),在處理前期過程中,cPTIO處理下的葡萄糖含量變化不明顯,第5、7天時,分別比CK下降了16.70%、34.34%。

圖4 NO對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片、根系葡萄糖含量變化的影響Fig.4 Effects of nitric oxide on glucose content of alfalfa seeding leaf and root under drought stress

2.2 NO對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗SS和SPS活性的影響

2.2.1NO對干旱脅迫下紫花苜蓿葉片、根系中SS活性的影響

由圖5可知,隨處理時間的延長,對照中紫花苜蓿葉片中SS活性呈現(xiàn)緩慢升高的變化趨勢,而干旱脅迫會使SS活性先升高后降低,第3天達(dá)到最大值,SNP、PEG處理SS活性分別比CK提高了43.45%、26.62%,PEG+SNP處理比PEG提高了15.34%。cPTIO處理在前期作用效果不顯著,在第7天,與CK相比SS活性降低了25.81%,PEG+cPTIO處理比 PEG顯著降低了32.84%。

由圖5可知,根系對照中SS活性隨時間延長變化不明顯,且其活性低于葉片。干旱脅迫使紫花苜蓿根系中SS活性呈先升高后下降,在第3天達(dá)到最大值。在第5、7天時,與PEG相比,PEG+SNP處理SS活性分別提高了85.41%、86.07%。在整個處理過程中,PEG+cPTIO的作用效果不顯著(P<0.05),cPTIO處理對根系中SS活性的作用效果比葉中顯著,第7天,cPTIO處理SS活性比CK下降了39.45%。

圖5 NO對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片、根系SS活性變化的影響Fig.5 Effects of nitric oxide on SS activity of alfalfa seeding leaf and root under drought stress

2.2.2NO對干旱脅迫下紫花苜葉片、根系中SPS活性的影響

如圖7所示,隨干旱脅迫時間的延長,紫花苜蓿葉片中SPS活性呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。第3天時,與CK相比, PEG 、cPTIO處理SPS活性降低了18.46%、16.97%,PEG+SNP、PEG+cPTIO處理比PEG降低了6.82%、11.27%。第5天,SNP處理SPS活性比CK提高了17.54%。第7天時,cPTIO處理SPS活性比CK降低了41.41%,PEG+SNP、PEG+cPTIO處理比PEG降低了15.32%、39.53%。

與葉相比,根系中SPS活性低于葉片。隨干旱脅迫時間的延長,根系中SPS活性呈先升高后下降的趨勢。第1天時,除PEG+SNP處理SS活性有顯著變化,其他處理均不顯著(P<0.05)。第3天,與CK相比,SNP、PEG+SNP處理SS活性分別提高了29.94%、51.34%。第5天,PEG+SNP處理比PEG處理提高了38.06%。不論水分條件如何,cPTIO均能降低根系中SPS活性,第7天,與CK相比,cPTIO處理SS活性降低了40.96%,PEG+cPTIO處理較PEG處理降低了52.82%。

圖6 NO對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片、根系SPS活性變化的影響Fig.6 Effects of nitric oxide on SPS activity of alfalfa seeding leaf and root under drought stress

2.3 NO對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗轉(zhuǎn)化酶活性的影響

2.3.1NO對干旱脅迫下紫花苜葉片、根系中AI活性的影響

如圖7所示,隨干旱脅迫時間的延長,紫花苜蓿葉片中AI活性呈逐漸下降的變化趨勢,在第1天,與CK相比,PEG處理AI活性提高了2.16倍。在第3天時,各處理之間差異顯著(P<0.05),PEG+SNP處理下AI活性比PEG處理提高了12.61%。不論水分條件如何, cPTIO處理下AI活性逐漸下降,第7天時,cPTIO處理比CK降低了30.62%,PEG+cPTIO處理較PEG處理下降了41.07%。

如圖7所示,隨干旱脅迫時間的延長,紫花苜蓿根系中AI活性呈逐漸下降的變化趨勢。在第1天,與CK相比,PEG處理AI活性提高了1.97倍。PEG+SNP處理下AI活性先升高后下降,在第3天達(dá)最大值,比PEG處理提高了28.89%。不論水分條件如何,cPTIO處理下AI活性逐漸下降,第3天時,與PEG處理相比,PEG+cPTIO處理降低了13.31%。在第7天,cPTIO處理AI活性比CK降低了54.51%,PEG+cPTIO與PEG處理相比無顯著性差異(P<0.05)。

圖7 NO對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片、根系A(chǔ)I活性變化的影響Fig.7 Effects of nitric oxide on acid invertase of alfalfa seeding leaf and root under drought stress

2.3.2NO對干旱脅迫下紫花苜葉片、根系中NI活性的影響

如圖8所示,隨干旱脅迫時間的延長,紫花苜蓿葉片NI活性呈現(xiàn)逐漸下降的變化趨勢。不論水分條件如何,SNP處理在前期作用不顯著,在第7天,SNP處理比CK提高了10.52%,PEG+SNP比PEG處理提高了33.05%。不管水分條件如何,cPTIO處理下NI活性呈現(xiàn)先升高后下降,在第3天達(dá)到最大值;在第7天,cPTIO、PEG+cPTIO處理NI活性分別比CK降低了28.63%、39.88%。

如圖8所示,根系中NI活性要低于葉片,隨干旱脅迫時間的延長,紫花苜蓿根系NI活性先升高后下降,在第3天達(dá)到最大值,PEG處理NI活性比CK提高了67.74%,PEG+SNP比PEG提高了13.89%,PEG+cPTIO處理NI活性比PEG降低了15.41%。第7天時,與CK相比,cPTIO處理NI活性顯著降低了77.74%(P<0.05),PEG+cPTIO處理不顯著。

圖8 NO對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片、根系NI活性變化的影響Fig.8 Effects of nitric oxide on neutral invertase of alfalfa seeding leaf and root under drought stress

3 討論

3.1 紫花苜蓿淀粉含量變化與NO和干旱脅迫的關(guān)系

NSC在植物體中含量的變化不僅能反映植物的生理活動狀況,還能反映植物對環(huán)境變化的響應(yīng)[29]。NSC 在不同器官中的分配格局是植物對環(huán)境適應(yīng)能力的綜合體現(xiàn)[30]。在逆境條件下,植物表現(xiàn)為淀粉含量下降,糖含量增加,而外源物質(zhì)的添加會增強(qiáng)這種特性,從而提高植物的抗逆適應(yīng)性[31]。研究表明NO可以提高逆境條件下植物中可溶性糖的含量[32-33]。可溶性糖作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),其直接參與植物體應(yīng)對干旱脅迫,淀粉是植物體中的重要儲能物質(zhì),兩者之間的互相轉(zhuǎn)化程度反映植物對環(huán)境變化的響應(yīng)[34]。本研究發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下,紫花苜蓿葉片中淀粉含量降低,干旱脅迫促進(jìn)了淀粉的水解以調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透勢,防止細(xì)胞的大量失水。與葉片相反,在根系中淀粉含量呈增加的趨勢,一方面干旱脅迫使地上部分中的淀粉運(yùn)往地下部分儲存,以提高紫花苜蓿的抗旱性,這與楊麗芝研究結(jié)果相似[35],另一方面可能是因為可溶性糖的大量增加會造成淀粉的積累[36]。與單純干旱脅迫相比,外源 NO作用下紫花苜蓿葉片中淀粉含量降低,根系中淀粉增加,說明外源NO可以調(diào)節(jié)淀粉在植物葉片、根系中的分配及其合成分解,使根系利用淀粉合成防御性化合物,對干旱脅迫起緩沖作用,增強(qiáng)紫花苜蓿的抗旱性。不論水分條件如何,NO清除劑cPTIO處理下葉片中淀粉含量逐漸下降,根系中淀粉含量先升高后下降,后期淀粉含量極低,說明cPTIO影響了淀粉的合成與分解及其分配,這將不利于植物形成穩(wěn)定的滲透勢,說明內(nèi)源NO的含量與淀粉的代謝密不可分。

3.2 紫花苜?？扇苄蕴呛孔兓cNO和干旱脅迫的關(guān)系

蔗糖在植物體內(nèi)是碳水化合物運(yùn)輸?shù)闹饕问絒37],干旱脅迫會影響蔗糖庫的大小,盡管干旱脅迫下碳素同化總量下降,但可溶性碳水化合物的含量增加,這樣可以提高細(xì)胞的滲透勢[38]。本研究結(jié)果表明,干旱脅迫下紫花苜蓿蔗糖含量先升高后下降,且葉片中蔗糖的含量要高于根系,說明干旱脅迫使葉片中的蔗糖合成分解更為活躍,在應(yīng)對干旱脅迫中發(fā)揮了更為主要的作用,之后蔗糖會進(jìn)一步水解為果糖和葡萄糖,這也正符合了果糖與蔗糖的含量變化趨勢,兩者在處理后期積累量最大。與蔗糖含量變化相反的是,根系中葡萄糖及果糖含量比葉片中要高,說明干旱脅迫下,葉片中分解得到的果糖和葡糖糖會優(yōu)先往紫花苜蓿根系中分配,這可能是可溶性糖供應(yīng)地下部分利用并修復(fù)受損組織[39]。外源NO處理不同程度地提高了干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗中蔗糖、葡萄糖和果糖的含量,與單純干旱脅迫下相比,外源NO處理下根系中葡萄糖和果糖含量增加幅度較大。這可能是由于NO能夠維持較高水平的光合作用和向下運(yùn)輸碳水化合物的能力。不論水分條件如何,cPTIO處理表現(xiàn)出對紫花苜蓿中可溶性糖代謝的抑制作用,但是在處理過程中,cPTIO處理下紫花苜蓿中可溶性糖含量大多數(shù)呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,可能的原因是NO的減少在短時間內(nèi)刺激了一氧化氮合酶(SNPS)和硝酸還原酶(NR)途徑產(chǎn)生更多NO,從而使其繼續(xù)發(fā)揮作用,隨時間延長代謝恢復(fù)正常水平,內(nèi)源NO減少,抑制可溶性糖的代謝。內(nèi)源NO在調(diào)控可溶性糖的代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。

3.3 干旱脅迫下紫花苜蓿SS和SPS活性對NO的響應(yīng)

植物體內(nèi)蔗糖代謝是一個復(fù)雜的過程,是蔗糖代謝相關(guān)酶類綜合互作用的結(jié)果[40]。SS,SPS是蔗糖代謝的重要酶類[41],在高等植物中,SS既能催化蔗糖合成又能催化其分解,是一種可逆酶,但通常認(rèn)為主要起分解蔗糖作用,SPS則被認(rèn)為是催化蔗糖合成的主要酶,相關(guān)酶活性的變化直接影響蔗糖庫的大小[42]。干旱脅迫降低了谷子幼苗SS和SPS的活性,同時外源物質(zhì)亞精胺則會提高其酶活性,促進(jìn)蔗糖等碳水化合物的積累[43]。本研究結(jié)果表明,正常生長下紫花苜蓿葉片中SS和SPS活性均比根系中要高。干旱脅迫下,葉片中SS活性先升高后下降,SPS活性逐漸降低,這與董彥紅和劉文夫的研究相似[28,44]。根系中SS和SPS活性先升高后下降,葉片中SS和SPS的活性仍然比根系中要高,葉片中蔗糖的合成與分解要比根中活躍。外源NO可以不同程度的提高紫花苜蓿葉片中SS活性及根系中SS和SPS活性,抑制葉片中SPS的活性,促進(jìn)葉片中蔗糖的分解,抑制蔗糖的合成,降低細(xì)胞的滲透勢,促進(jìn)細(xì)胞吸水從而減輕對植株的傷害;而葉片分解的果糖和蔗糖更多的運(yùn)往根系,根系中SS和SPS處于高水平的動態(tài)平衡中,促進(jìn)蔗糖的合成與分解,維持正常的細(xì)胞滲透勢,緩解干旱脅迫對根系造成的損傷。而cPTIO 則會不同程度的鈍化SS和SPS的活性,說明內(nèi)源NO的減少可以通過抑制SS和SPS的活性,進(jìn)而影響到可溶性糖的代謝,不利于植物在逆境中生存。

3.4 干旱脅迫下紫花苜蓿AI和NI活性對NO的響應(yīng)

轉(zhuǎn)化酶是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶,能不可逆地催化蔗糖分解為葡萄糖和果糖, 根據(jù)其最適 pH,將其分為酸性轉(zhuǎn)化酶、中性轉(zhuǎn)化酶和堿性轉(zhuǎn)化酶[45-46],在植物生長發(fā)育及應(yīng)對環(huán)境脅迫中起重要作用[47]。轉(zhuǎn)化酶在植物正常生長中的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蔗糖合成酶[48],與本研究結(jié)果相似,本研究中葉片中轉(zhuǎn)化酶的活性顯著高于蔗糖合成酶。研究表明,低溫脅迫能提高木薯中的 NI活性并且表現(xiàn)為短期提高[49]。程智慧等研究表明番茄中轉(zhuǎn)化酶在水分脅迫前期活性升高,后期降低,轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)水平與鹽脅迫強(qiáng)度和時間有密切關(guān)系[50]。外源物質(zhì)的使用可以有效調(diào)節(jié)脅迫下植物轉(zhuǎn)化酶的活性,從而增強(qiáng)植物的抗逆性[51-52]。本試驗研究結(jié)果表明紫花苜蓿葉片中AI和NI的活性均比根系要高。干旱脅迫下,葉片及根系中AI和NI活性均呈先逐漸下降的變化趨勢,且對干旱脅迫十分敏感,在脅迫后期活性迅速下降。干旱脅迫下,葉中轉(zhuǎn)化酶的活性仍然比根中要高,然而根系中果糖和葡萄糖和含量要高于葉片,這更加證明了葉片中分解得到的果糖和葡萄糖會優(yōu)先向根中分配,減輕根部的損傷。外源NO可以不同程度的提高干旱脅迫下紫花苜蓿中AI和NI的活性,促進(jìn)蔗糖的分解為更多的果糖和葡萄糖,參與細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)。同時,轉(zhuǎn)化酶也是合成其他有機(jī)溶質(zhì)的碳架和能量來源,可提高植物抗逆性,使植株維持正常代謝水平。而cPTIO則會降低AI和NI的活性,說明內(nèi)源NO的減少會影響轉(zhuǎn)化酶的正常表達(dá),可能的原因是內(nèi)源NO在調(diào)控轉(zhuǎn)化酶代謝中發(fā)揮重要的作用,其含量的減少會嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化酶的正常代謝。在處理后期,PEG+cPTIO處理下根系中轉(zhuǎn)化酶活性與單獨(dú)脅迫處理差異不顯著,可能是隨脅迫時間的延長,原生質(zhì)體和細(xì)胞壁脫水引起細(xì)胞塌陷,進(jìn)而造成機(jī)械損傷及代謝紊亂。``

4 結(jié)論

不同處理下紫花苜蓿葉片和根系NSC濃度及其代謝關(guān)鍵酶活性的動態(tài)變化表明,干旱脅迫會對紫花苜蓿NSC濃度及代謝酶活性產(chǎn)生影響,使NSC發(fā)生重新的轉(zhuǎn)化與分配,而外源噴施NO可以通過增強(qiáng)干旱脅迫下紫花苜蓿葉片和根系中SS、SPS、AI及NI的活性,促進(jìn)NSC的轉(zhuǎn)化與分配往有利植物生長的方向進(jìn)行,降低了滲透勢,促進(jìn)細(xì)胞吸水,緩解干旱造成的損傷。而NO清除劑的使用揭示了紫花苜蓿中內(nèi)源NO可以通過調(diào)控NSC濃度及其相關(guān)酶的代謝響應(yīng)干旱脅迫,并表現(xiàn)出抑制作用。此研究可為外源NO在植物抗逆中的應(yīng)用與內(nèi)源NO的功能研究提供重要依據(jù)。因此建議在干旱地區(qū)種植和培育紫花苜蓿的過程中,可以考慮通過外源噴施0.1 mmol/L NO增強(qiáng)紫花苜蓿的適應(yīng)能力,減輕干旱脅迫對紫花苜蓿產(chǎn)量和質(zhì)量影響。