韓 樂(lè)，陳文娟，雷光焰，趙 征

1.陜西省腫瘤醫(yī)院胸外科 (西安 710061)；2.陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)三科 (西安 710061)

肺癌是全世界癌癥死亡的主要原因，其發(fā)病率逐年升高[1]。microRNA是一種非蛋白質(zhì)編碼RNAs，可準(zhǔn)確了解腫瘤發(fā)展進(jìn)程[2]。研究表明，microRNA可能參與調(diào)控肺癌的發(fā)展，并在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。microRNA是一種內(nèi)源性的長(zhǎng)度大約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，主要通過(guò)切割目標(biāo)mRNAs或抑制其翻譯來(lái)沉默基因表達(dá)，多種microRNA可能在多種腫瘤癌變過(guò)程中起著重要作用[4]。microRNA-21作為最豐富的的腫瘤基因之一，幾乎在所有腫瘤細(xì)胞中表達(dá)均高于正常對(duì)照組，與肺癌的發(fā)展密切相關(guān)，可參與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移[5-6]。microRNA-25是人染色體7q22.1的miR-106-25基因簇成員之一，參與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展，microRNA-25在肺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常值[7-8]。本研究通過(guò)探討microRNA-21、microRNA-25在肺癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)情況，分析microRNA-21、microRNA-25在肺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系以及與肺癌患者生存情況的關(guān)系，并分析microRNA-21、microRNA-25的相關(guān)性，旨在為肺癌分子靶向治療提供理論依據(jù)。

資料與方法

1 一般資料 選取2011年1月至2014年1月我院收治的肺癌患者85例，采集手術(shù)切除的癌組織標(biāo)本(研究組)及其癌旁組織(對(duì)照組)，其中男49例，女36例，年齡35～78歲，平均年齡(55.68±7.41)歲；腫瘤直徑1.5～8.0 cm；腫瘤TNM分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期28例，Ⅲ期22例，Ⅳ期19例；病理類(lèi)型腺癌37例，鱗癌48例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移71例。所有患者進(jìn)行建檔，第1年每月進(jìn)行1次隨訪，后每3個(gè)月隨訪1次，3年后每半年隨訪1次，隨訪時(shí)間5年?；颊咧?，標(biāo)本采集通過(guò)我院生命科學(xué)倫理學(xué)審查委員會(huì)批準(zhǔn)。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理確診為原發(fā)性肺癌；②均為首發(fā)病例；③術(shù)前均未接受放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤患者；②繼發(fā)性肺癌患者；③嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙者；④臨床資料不完整者。

2 研究方法 ①募集所有患者新鮮肺癌組織及其癌旁正常組織(距離癌組織邊緣≥3 cm)各85份，組織剪成薄片，每50 mg樣品加入1 ml Trizol裂解液，采用Trizol試劑盒提取肺癌組織及其癌旁正常組織總RNA，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA完整性做出判斷，使用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度以及濃度，選取電泳條帶18 s，28 s條帶非常清晰，邊角銳利，28s條帶的亮度在18s條帶的兩倍或者兩倍以上，泳道內(nèi)沒(méi)有拖尾以及A260mm/A280mm比值在1.8～2.0之間的樣品進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；②將提取的總RNA使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，濃度在200～2000 ng/μl，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)加入各試劑，得到cDNA保存?zhèn)溆?，反?yīng)條件：第一步，70°C 10 min，4°C 5 min；第二步，25°C 10 min，50°C 60 min，90°C 5 min，4°C 1 min；③實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用SYBR Green試劑盒完成，反應(yīng)體系20 μl，選擇Roche熒光定量PCR系統(tǒng)上機(jī)檢測(cè)，反應(yīng)條件：95°C 15 min，1個(gè)循環(huán)，95°C 15 s，55°C 30 s，70°C 30 s，40個(gè)循環(huán)，microRNA-21實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列為：上游5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCTIATCAGACTGA-3'，下游5'-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3'；microRNA-25實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列為：上游5'-CATTGCACTTGTCTCGGTCTGA-3'，下游5'-TCAGACCGAGACAAGTGCAATG-3'；內(nèi)參U6實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列為：上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；④所得原始數(shù)據(jù)采用相對(duì)定量2一△△Ct方法進(jìn)行分析，Ct值>35數(shù)據(jù)舍去，取三個(gè)復(fù)孔平均值為microRNA-21、microRNA-25 PCR擴(kuò)增的最終Ct值，其中△△Ct=(microRNA-21/microRNA-25-內(nèi)參U6)(研究組)-(microRNA-21/microRNA-25-內(nèi)參U6)(對(duì)照組)。

結(jié) 果

1 兩組microRNA-21、microRNA-25表達(dá)水平比較 研究組microRNA-21、microRNA-25 mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2 microRNA-21、microRNA-25在肺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 microRNA-21、microRNA-25表達(dá)水平與肺癌患者TNM分期有關(guān)(P<0.05)，與Ⅰ、Ⅱ期患者相比，Ⅲ、Ⅳ期患者癌組織中microRNA-21、microRNA-25表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，而microRNA-21、microRNA-25表達(dá)水平與患者性別、年齡、是否吸煙、腫瘤大小、病理類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表1 兩組microRNA-21、microRNA-25表達(dá)水平比較

表2 microRNA-21、microRNA-25在肺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 microRNA-21、microRNA-25表達(dá)與肺癌患者生存情況關(guān)系 Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，肺癌患者癌組織中microRNA-21高表達(dá)組中位生存期27.96個(gè)月(95% CI：26.79～29.14)，5年生存率26.47%，microRNA-21低表達(dá)組中位生存期37.42個(gè)月(95% CI：33.34～41.51)，5年生存率76.47%，microRNA-21高表達(dá)組中位生存期顯著短于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=10.53，P<0.05)；microRNA-25高表達(dá)組中位生存期32.85個(gè)月(95% CI：31.28～34.42)，5年生存率24.59%，microRNA-25低表達(dá)組中位生存期45.22個(gè)月(95% CI：42.20～48.24)，5年生存率66.67%，microRNA-25高表達(dá)組中位生存期顯著短于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=17.31，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 microRNA-21(左)、microRNA-25(右)表達(dá)與肺癌患者生存情況關(guān)系

4 microRNA-21、microRNA-25在肺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，肺癌組織中microRNA-21表達(dá)與microRNA-25表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.645，P<0.05)。

討 論

肺癌已成為最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，且大多數(shù)肺癌早期無(wú)明顯癥狀，患者難以被早期診斷，很多患者確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期，因此對(duì)肺癌患者進(jìn)行早期診斷治療，有助于早期發(fā)現(xiàn)并給予肺癌患者及時(shí)有效治療，進(jìn)而提高患者生存預(yù)后，延長(zhǎng)患者生命[9]。microRNA作為基因表達(dá)重要的調(diào)節(jié)因子，在多種細(xì)胞過(guò)程以及包括腫瘤在內(nèi)的疾病發(fā)展過(guò)程中具有重要的作用[10]。microRNA-21是最早檢測(cè)到的microRNA之一，參與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，其在肺癌發(fā)病以及治療過(guò)程中的作用越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注[11]。報(bào)道表明，microRNA-21在多種腫瘤組織中呈顯著上調(diào)，如microRNA-21在胃癌組織中上調(diào)表達(dá)，且microRNA-21高表達(dá)與胃癌患者不良預(yù)后呈顯著相關(guān)[12-13]。同樣，microRNA-21在結(jié)直腸癌、肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤中高水平表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移[14]。唐曦等[15]發(fā)現(xiàn)，microRNA-21在肺腺癌患者血清中顯著升高，血清中microRNA-21肺腺癌診斷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。張軒斌等[16]報(bào)道也表明，microRNA-21在非小細(xì)胞肺癌患者外周血以及癌組織中的表達(dá)水平顯著高于同期肺部良性病變患者以及癌旁組織。本研究結(jié)果顯示，microRNA-21在肺癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，其表達(dá)與肺癌患者TNM分期有關(guān)，Ⅲ、Ⅳ期患者癌組織中microRNA-21表達(dá)水平顯著高于Ⅰ、Ⅱ期患者，而與患者性別、年齡、是否吸煙、腫瘤大小、病理類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性，表明microRNA-21在肺癌癌組織中上調(diào)表達(dá)，可能作為肺癌進(jìn)展的一種腫瘤標(biāo)志物，與既往文獻(xiàn)報(bào)道具有一致性。Kaplan-Meier生存分析顯示，microRNA-21高表達(dá)組生存率顯著低于低表達(dá)組，表明microRNA-21表達(dá)水平與肺癌患者生存密切相關(guān)，其高表達(dá)提示患者預(yù)后不佳，可能作為肺癌預(yù)后判斷的指標(biāo)之一。

microRNA-25屬于miR-106-25基因簇成員，在腫瘤中起著原癌基因作用[17]。研究表明，microRNA-25在肺癌、胃癌以及乳腺癌等多種腫瘤組織中高水平表達(dá)，其可通過(guò)參與調(diào)控p53信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生、發(fā)展[18]。Chen等[19]指出，microRNA-25在非小細(xì)胞肺癌組織中顯著上調(diào)，并與RGS3蛋白呈顯著負(fù)相關(guān)，其可能通過(guò)抑制RGS3表達(dá)參與肺癌發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，microRNA-25在肺癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，其表達(dá)與肺癌患者TNM分期有關(guān)，Ⅲ、Ⅳ期患者癌組織中microRNA-25表達(dá)水平顯著高于Ⅰ、Ⅱ期患者，而與患者性別、年齡、是否吸煙、腫瘤大小、病理類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性，表明microRNA-25在肺癌癌組織中顯著上調(diào)表達(dá)，其可能在肺癌進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮作用，與既往報(bào)道相符。Kaplan-Meier生存分析顯示，microRNA-25高表達(dá)組生存率顯著低于低表達(dá)組，表明microRNA-25表達(dá)檢測(cè)有助于肺癌預(yù)后判斷。

本文研究結(jié)果還顯示，肺癌組織中microRNA-21表達(dá)與microRNA-25表達(dá)呈顯著正相關(guān)，表明兩者聯(lián)系緊密，在肺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中均起重要作用。Guo等[20]報(bào)道表明，通過(guò)降低COX-19表達(dá)來(lái)抑制microRNA-21促進(jìn)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖。此外，張軒斌等[16]報(bào)道指出，microRNA-21可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)PTEN蛋白表達(dá)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、侵襲過(guò)程，其可能作為肺癌診斷和治療的潛在分子指標(biāo)。研究顯示，microRNA-25通過(guò)靶向作用FBXW7，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌增殖、運(yùn)動(dòng)[21]。但有關(guān)microRNA-21、microRNA-25共同調(diào)控肺癌腫瘤細(xì)胞增殖機(jī)制的報(bào)道較少，二者究竟如何共同參與肺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的分子機(jī)制尚不明確，還需后續(xù)進(jìn)一步研究。總之，檢測(cè)肺癌癌組織中microRNA-21、microRNA-25表達(dá)水平，可能有助于判斷肺癌進(jìn)展以及評(píng)估患者預(yù)后，為臨床治療提供參考。

綜上所述，microRNA-21、microRNA-25在肺癌組織中呈高水平表達(dá)，其表達(dá)水平與患者臨床分期有關(guān)，且肺癌組織中microRNA-21表達(dá)與microRNA-25表達(dá)呈顯著正相關(guān)，上述指標(biāo)有可能能夠預(yù)測(cè)肺癌發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后，對(duì)肺癌診治有一定的臨床意義。