曹育，武峻艷，安玉蘭

(山西中醫(yī)藥大學(xué)，太原 030024)

近年來，全球糖尿病患病人數(shù)不斷增長，已經(jīng)嚴(yán)重危害到人類的健康，據(jù)世界衛(wèi)生組織的不完全統(tǒng)計，全球每年新增糖尿病患者數(shù)達(dá)700萬人[1]。糖尿病分為1型糖尿病和2型糖尿病，其中2型糖尿病占到了總發(fā)病人數(shù)的90%以上，現(xiàn)在研究較多的是2型糖尿病。2型糖尿病還會引發(fā)很多并發(fā)癥，如糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病周圍神經(jīng)病變等。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對2型糖尿病治療尚無特別有效的方法[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)[4]，經(jīng)過針刺治療(電針、皮內(nèi)針)后，大鼠的空腹血糖和胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、細(xì)胞功能及血脂水平都得到了明顯的改善，說明針刺治療能在一定程度上降低血糖、改善胰島素抵抗，保護(hù)胰島功能，延緩病情進(jìn)展，但是具體的機(jī)制尚不清楚。有研究[5]表明，針刺(電針、皮內(nèi)針)療法可以有效提高GLP-1水平，可能因此而改善胰島β細(xì)胞功能障礙?；谝陨涎芯浚緦?shí)驗(yàn)首次探究皮內(nèi)針刺激足三里對2型糖尿病大鼠的改善作用。

1 材料與方法

1.1 動物

Wistar雄性大鼠30只，體質(zhì)量200 g左右，購于蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號SCXK(蘇)2017-05。

1.2 試劑及儀器

鏈脲佐菌素(streptozotocin， STZ)購自 Sigma公司；胰島素測定試劑盒購自上海基免實(shí)業(yè)有限公司；丙二醛(malondialdehyde， MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)試劑盒、活性氧(reactive oxygen species， ROS)試劑盒購自碧云天生物有限公司。p22phox(1：1000)、NOX4(1：500)抗體購自美國Santa公司；β-actin抗體(1：1000)購自北京中杉金橋生物公司；BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光液購自美國Santa公司；組織自動脫水機(jī)(型號 TS-12N)購于湖北孝感宏業(yè)醫(yī)用器材有限公司；石蠟切片機(jī)(型號 RM2235)購于德國Leica公司；垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽(型號 VE-186)購于美國天能有限公司；正置顯微鏡(型號 BX41)購于日本 Olympus公司；引物沈陽鼎國生物公司合成捷基合成。各引物序列見表1。

表1 各引物序列

1.3 造模[6]、分組及血糖測定

隨機(jī)選取30只大鼠喂高糖高脂飼料，持續(xù)喂養(yǎng)4周，4周以后通過尾靜脈注射STZ溶液(30 mg/kg)，造2型糖尿病大鼠模型。并于注射STZ 3 d后禁食不禁水12 h，測定大鼠空腹血糖，血糖值達(dá)11～33 mmol/L即為造模成功，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為B組、C組，每組10只，B組只固定，不針刺；C組將大鼠固定于鼠板上，使雙后肢充分暴露，根據(jù)中國針灸學(xué)會實(shí)驗(yàn)針灸研究會制定的“動物針灸穴位圖譜”找到雙側(cè)足三里穴，采用皮內(nèi)針刺入約0.2 mm并留針30 min，每日干預(yù)1次，連續(xù)干預(yù)2周。A組為隨機(jī)選取10只大鼠，喂普通飼料。皮內(nèi)針干預(yù)2周后禁食12 h尾尖取血，采用羅氏血糖儀再次測定空腹血糖。

1.4 各組大鼠血清中MDA、SOD、ROS及胰島素的測定

末次刺激以后，3組大鼠通過腹主動脈采血約5 mL，低溫離心10 min取血清，采用相關(guān)試劑盒測定各組大鼠血清中MDA、SOD、ROS及胰島素的含量。

1.5 HE染色法觀察各組大鼠胰腺組織的損傷情況[6]

將各組胰腺組織放入已經(jīng)配制好的 4%多聚甲醛固定液中，固定3 d。放入不同濃度的乙醇中進(jìn)行脫水。脫水后浸到不同濃度的二甲苯溶液中進(jìn)行透明。透明后在不同濃度的蠟溶物中進(jìn)行浸蠟。再放到包埋盒中進(jìn)行包埋。固定到切片機(jī)上進(jìn)行 5 μm手動切片。切片后進(jìn)行烤片脫蠟，HE染色。

1.6 ReaI time PCR法測定各組胰腺組織中p22phox、NOX2 mRNA水平[7]

采用總RNA提取試劑盒(RNA Isolation Kit)提取RNA，并采用核酸蛋白檢測儀測定 RNA純度和濃度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RNA First- Strand cDNA Synthesis Kit)合成cDNA。采用實(shí)時熒光定量PCR(q RT-PCR)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性 30 s，60℃反應(yīng)40 s，72℃變性30 s，30個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△△Ct法計算相對表達(dá)量?！鳌鰿t計算公式：△△Ct=(Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組－(Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因)對照組。

1.7 Western bIot檢測各組大鼠氧化相關(guān)蛋白表達(dá)情況[8]

每只大鼠取胰腺組織約200 mg，剪碎后加入RIPA裂解液，勻漿裂解蛋白，低溫離心取上清液備用，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。煮沸蛋白變性，配制10%凝膠進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗過夜。加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。涂勻ECL化學(xué)發(fā)光曝光5 min，凝膠成像儀呈像。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠空腹血糖、MDA、SOD、ROS及InsuIin水平比較

3組大鼠空腹血糖、MDA、SOD、ROS及 Insulin水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與A組相比，B組、C組空腹血糖及血清中MDA、ROS水平升高，而SOD及Insulin水平降低(P＜0.05)；與B組相比，C組空腹血糖及血清MDA、ROS水平降低，而SOD及Insulin水平升高(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠空腹血糖及血清中MDA、SOD、ROS、InsuIin水平比較 ()

表2 各組大鼠空腹血糖及血清中MDA、SOD、ROS、InsuIin水平比較 ()

注：與A組比較1)P＜0.05；與B組比較2)P＜0.05

組別 n 血糖(mmol/L) MDA(nmol/L) SOD(U/L) ROS(U/mL) Insulin(μg/L)A 組 10 7.11±2.94 2.69±1.17 24.89±4.54 27.42±6.24 1.34±0.45 B 組 10 19.55±0.901) 5.98±1.281) 11.12±3.761) 37.63±2.591) 0.69±0.231)C 組 10 10.21±1.231)2) 3.54±1.321)2) 18.65±4.651)2) 32.63±6.361)2) 0.98±0.261)2)

2.2 HE染色法觀察各組大鼠胰腺組織的損傷情況

顯微鏡下觀察結(jié)果可見，A組胰腺胰島內(nèi)細(xì)胞排列整齊，大小一致，分布均勻；B組胰島內(nèi)細(xì)胞分布稀疏，形狀不規(guī)則，排列紊亂，可見空泡樣變；C組胰島內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯改善。詳見圖1。

圖1 各組大鼠胰腺組織HE結(jié)果(HE,×400)

2.3 各組大鼠胰腺組織中的p22phox、NOX2 mRNA含量比較

各組胰腺組織p22phox、NOX2 mRNA含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。B組和C組p22phox、NOX2 mRNA含量與A組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。C組p22phox、NOX2 mRNA水平明顯低于B組(P＜0.05)。詳見表3。

表3 各組胰腺組織中p22phox、NOX2 mRNA含量比較()

表3 各組胰腺組織中p22phox、NOX2 mRNA含量比較()

注：與A組比較1)P＜0.05；與B組比較2)P＜0.05

組別 n p22phox mRNA NOX2 mRNA A組 10 0.51±0.16 0.45±0.15 B組 10 1.14±0.171) 1.26±0.131)C組 10 0.79±0.181)2) 0.86±0.211)2)

2.4 各組胰腺組織p22phox、NOX2蛋白表達(dá)情況比較

結(jié)果表明，各組胰腺組織p22phox、NOX2蛋白比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。B組和C組p22phox、NOX2蛋白含量與 A組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。C組p22phox、NOX2蛋白含量比B組明顯減少(P＜0.05)。詳見圖2、表4。

圖2 各組胰腺組織p22phox、NOX2蛋白表達(dá)情況

表4 各組胰腺組織中p22phox、NOX2蛋白含量比較 ()

表4 各組胰腺組織中p22phox、NOX2蛋白含量比較 ()

注：與A組比較1)P＜0.05；與B組比較2)P＜0.05

組別 n p22phox NOX2 A組 10 0.35±0.17 0.38±0.16 B組 10 1.21±0.131) 1.08±0.091)C組 10 0.76±0.211)2) 0.69±0.111)2)

3 討論

2型糖尿病典型的癥狀是胰島B細(xì)胞受到破壞，導(dǎo)致胰島素分泌不足或產(chǎn)生了嚴(yán)重的胰島素抵抗。胰島素由胰島B細(xì)胞分泌，是唯一能降低血糖的激素。有研究表明[5]，針刺、皮內(nèi)針均能改善2型糖尿病大鼠損傷情況，并且皮內(nèi)針的效果更好，作者推測可能與針刺深度、刺激量有關(guān)，其機(jī)制可能與腧穴局部組織分布不同以及激活的粗細(xì)神經(jīng)纖維不同有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)先選擇了皮內(nèi)針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以高脂飼料聯(lián)合STZ建立2型糖尿病大鼠，通過測定空腹血糖，發(fā)現(xiàn)皮內(nèi)針刺激足三里會明顯降低2型糖尿病大鼠的血糖水平。筆者采用HE染色法觀察了糖尿病大鼠胰腺組織的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，皮內(nèi)針刺激足三里對大鼠的胰腺組織有明顯的改善作用，說明皮內(nèi)針刺激足三里對糖尿病確實(shí)有改善作用，但是其作用機(jī)制有待考察。糖尿病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其具體機(jī)制仍不清楚[9-12]。近年來，糖尿病在中醫(yī)學(xué)中被認(rèn)為是氣虛陰虧之癥，中醫(yī)多層次的治療糖尿病也起到了明顯的效果[13]。目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。產(chǎn)生氧化應(yīng)激的原因主要是糖尿病患者機(jī)體代謝紊亂，導(dǎo)致 ROS過度產(chǎn)生，抗氧化物如SOD產(chǎn)生減少，有害代謝物產(chǎn)生增多如MDA[14-15]。本實(shí)驗(yàn)就有關(guān)氧化應(yīng)激的指標(biāo)進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，皮內(nèi)針刺激足三里會使大鼠血清中 ROS和MDA的含量減少，而SOD的產(chǎn)生增多，說明皮內(nèi)針刺激足三里能夠緩解糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激。

NADPH氧化酶系是ROS在應(yīng)激狀態(tài)下的主要來源，筆者推測NADPH氧化酶系也參與了氧化應(yīng)激所以又進(jìn)一步探究了影響氧化應(yīng)激的因素。NADPH氧化酶系位于細(xì)胞膜上，是一類特殊的電子傳遞鏈復(fù)合物，由7個亞基構(gòu)成，包括 NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5和DOX1/DOX2，其中 p22phox是構(gòu)成 NOX2、NOX4、NOX5的基礎(chǔ)亞基，p22phox能夠間接反映NOX2、NOX4、NOX5的水平，p22phox與 NADPH氧化酶系密切相關(guān)[16-17]。NADPH氧化酶系在細(xì)胞組織處于應(yīng)激狀態(tài)時會過度地產(chǎn)生ROS，從而加重機(jī)體的氧化應(yīng)激，說明NADPH氧化酶與ROS產(chǎn)生有直接關(guān)系。研究[18-19]表明，糖尿病患者單核細(xì)胞中ROS增多，同時會存在NOX2及p22phox激活的現(xiàn)象，且p22phox和MDA水平呈明顯的正相關(guān)，總體說明NOX2及p22phox在整個機(jī)體氧化應(yīng)激的過程中起主要作用，所以本實(shí)驗(yàn)首先通過 PCR法檢測了胰腺組織中NOX2及p22phox的mRNA水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病大鼠胰腺組織NOX2及p22phox的mRNA水平會明顯升高，說明糖尿病確實(shí)會誘導(dǎo) NADPH氧化酶系的激活，而皮內(nèi)針刺激足三里會使糖尿病大鼠 NOX2及p22phox的mRNA水平明顯降低，說明皮內(nèi)針刺激足三里對糖尿病氧化應(yīng)激能夠起到緩解作用。為了進(jìn)一步考察NOX2及p22phox的變化，本實(shí)驗(yàn)又采用WB檢測了NOX2及p22phox蛋白的變化情況，結(jié)果表明，糖尿病大鼠胰腺組織NOX2及p22phox蛋白的含量明顯升高，說明糖尿病確實(shí)存在 NADPH氧化酶系的激活，由于 NOX的激活導(dǎo)致ROS過多積累進(jìn)而誘發(fā)氧化應(yīng)激，有研究[20]表明，NOX2在胰島細(xì)胞中會有表達(dá)，但是在高糖的刺激下 NOX2會過度表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)與之前的研究結(jié)果一致。比較糖尿病大鼠與皮內(nèi)針刺激足三里大鼠胰腺組織NOX2及p22phox的蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)皮內(nèi)針刺激足三里能明顯抑制NOX2和p22phox表達(dá)水平。提示皮內(nèi)針刺激足三里能調(diào)節(jié)糖尿病大鼠胰腺NOX2、p22phox蛋白表達(dá)水平進(jìn)而影響糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究顯示，2型糖尿病大鼠存在氧化應(yīng)激，皮內(nèi)針刺激足三里能夠降低氧化應(yīng)激的相關(guān)指標(biāo)ROS及MDA，總體皮內(nèi)針刺激足三里對2型糖尿病的損傷有明顯改善作用，其作用機(jī)制是通過抑制氧化應(yīng)激的上游調(diào)節(jié)因子NADPH氧化酶系中的NOX2及p22phox起作用。皮內(nèi)針刺激足三里對于臨床2型糖尿病的作用還有待進(jìn)一步研究。