吉沐祥　鄔劼　王曉琳　黃潔雪　朱建飛　饒斌

摘要：為明確葉菌唑與肟菌酯的復配增效作用，在實驗室條件下，以葡萄炭疽病菌（Glomerella cingulata）和白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）為供試病原菌，采取菌絲生長速率法，測定葉菌唑、肟菌酯以及二者混用對葡萄炭疽病菌和白腐病菌的毒力。結果表明，采用SR值法篩選得到葉菌唑與肟菌酯（復配組合3 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶5）的最佳配比為1 ∶3，對葡萄炭疽病菌和白腐病菌的EC50值分別為0.614 7、0.939 8 μg/mL;田間防效調查結果表明，40%肟菌酯·葉菌唑4 500倍液、3 000倍液、1 500倍液、10%葉菌唑1 500倍液和30%肟菌酯1 500倍液施藥后50 d對葡萄炭疽病防效依次為53.00%、64.35%、73.85%、68.87、55.12%，對白腐病的防效依次為74.29%、82.29%、90.94%、8352和59.45%，40%肟菌酯·葉菌唑1 500倍液對葡萄炭疽病和白腐病的防效顯著高于30%肟菌酯1 500倍液，對炭疽病的防效高于10%葉菌唑1 500倍液，但未達到顯著性差異，對白腐病的防效顯著高于10%葉菌唑1 500倍液。因此，肟菌酯和葉菌唑復配防治葡萄炭疽病和白腐病增效明顯，其中以質量比1 ∶3混合后對葡萄炭疽病菌和白腐病菌防治增效作用最為顯著，果穗套袋前可采用40%肟菌酯·葉菌唑1 500倍液浸果防治葡萄炭疽病和白腐病。

關鍵詞：葡萄炭疽病;葡萄白腐病;肟菌酯;葉菌唑;復配;田間防效

中圖分類號：S436.631.1+5 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）19-0098-05

收稿日期：2018-12-31

基金項目：江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（16）1013];江蘇省句容市農業(yè)科技支撐計劃（編號：NY2018571423）。

作者簡介：吉沐祥（1963—），男，江蘇寶應人，研究員，主要從事植保農藥與果樹病蟲害綠色防控技術研發(fā)。Tel：（0511）80978060;E-mail：jilvdun2800@163.com。

葡萄（Vitis vinifera L.）是世界上產量最大的水果之一，其產量居世界水果第二位[1]。我國是葡萄生產大國，由于大多數葡萄栽培地區(qū)連年種植，導致病原菌菌源積累，從而使葡萄炭疽病和白腐病成為葡萄生產上的主要病害[2-3]。葡萄炭疽病主要是由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的。該病菌主要危害葉片，也危害果實、當年生新枝蔓、卷須、葉柄等組織，造成10%～15%產量損失[5-6]。葡萄白腐病是由白腐盾殼霉（Coniella diplodiella）侵染引起的[4]。該病菌侵染迅速，主要危害果穗、枝蔓和葉片，給葡萄生產構成極大威脅[7]。

化學防治仍是當前防治葡萄白腐病和炭疽病的主要手段。目前，防治葡萄白腐病和炭疽病的常用藥劑有福美雙、代森錳鋅、多菌靈、甲基硫菌靈、咪鮮胺、氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯和腈菌唑等。有研究表明，由于頻繁使用，這些常用藥劑對葡萄炭疽病的防效已顯著下降，病菌已對甲基硫菌靈和多菌靈產生抗性[3，8]。因此，須篩選出防治葡萄白腐病和炭疽病的新藥劑，通過不同作用機制的殺菌劑輪換交替使用來抑制病菌抗性產生，從而滿足生產需求。葉菌唑是由日本吳羽化學公司研發(fā)的新款三唑類殺菌劑，是病菌細胞膜的重[HJ1.4mm]要組分麥角甾醇生物合成中C-14脫甲基化酶抑制劑，其殺菌譜廣泛，活性高，對非靶標生物低毒[9]。脫甲基化抑制劑殺菌劑是有效控制炭疽病的一種化學類極少見的單位點殺菌劑，葉菌唑對從桃樹中分離到的大多數炭疽病菌小種有效[10]，除了C. truncatum小種[11]。肟菌酯是從天然產物[CM（26]β-甲氧基丙烯酸酯衍生物開發(fā)的一類新的含氟殺菌劑，具有廣譜、高效、低毒等特點[12]。因此，本研究測定葉菌唑、肟菌酯對葡萄炭疽病菌及白腐病菌的室內生物活性以及二者按不同配比復配后的生物活性，并通過田間試驗評價2種藥劑混用對葡萄炭疽病和白腐病的防治效果，以期為開發(fā)防治葡萄白腐病和炭疽病的新藥劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

葡萄炭疽病菌（Glomerella cingulata）和白腐病菌（Coniothyrium diplodiella），采自江蘇省句容市華陽鎮(zhèn)下甸村葡萄園，由江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農業(yè)科學研究所植保研究室分離、鑒定并保存?zhèn)溆?。菌株保存于馬鈴薯蔗糖瓊脂（PDA）斜面上（4 ℃）。實驗室內在PDA培養(yǎng)基平板上轉接1次后，于26 ℃條件下預培養(yǎng)3 d，從菌落邊緣取直徑為5 mm的菌絲塊用于測定。

1.1.2 供試藥劑

主要試劑有95%葉菌唑原藥（江蘇輝豐生物農業(yè)股份有限公司）、97%肟菌酯原藥（江蘇耕耘化學有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥液的配制及濃度設計

母液配制：將葉菌唑原藥和肟菌酯原藥用甲醇溶解配制成1 000 μg/mL的母液。

炭疽病菌各藥劑單劑與復配劑的濃度設計：葉菌唑在含藥PDA培養(yǎng)基中的濃度為0.062 5、0. 125、0.25、0.50、1、2 μg/mL;肟菌酯在含藥PDA培養(yǎng)基中的濃度為0.25、0.5、1、2、4、8 μg/mL;葉菌唑·肟菌酯（質量比3 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶5）復配劑在含藥PDA中的濃度均為0.062 5、0125、0.25、0.5、1、 2 μg/mL。單劑與復配劑的濃度設計均為7個2倍稀釋的梯度濃度含藥PDA培養(yǎng)基。

白腐病菌各藥劑單劑與復配劑的濃度設計：葉菌唑在含藥PDA培養(yǎng)基中的濃度為0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 μg/mL;肟菌酯在含藥PDA培養(yǎng)基中的濃度為0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10 μg/mL;葉菌唑·肟菌酯（質量比 3 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶5）復配劑在含藥PDA中的濃度為0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5 μg/mL。單劑與復配劑的濃度設計均為7個2倍稀釋的梯度濃度含藥PDA培養(yǎng)基。除母液外，所有試驗藥劑系列濃度的藥液均為現配現用。

1.2.2 殺菌劑對葡萄炭疽病菌和白腐病菌的室內毒力測定

在溫度為25 ℃條件下培養(yǎng)3 d后利用十字交叉法測量各處理菌落直徑，以不含殺菌劑的PDA培養(yǎng)基為對照，每處理重復4次。計算出藥劑的抑制百分率，按毒力回歸方程y=a+bx計算藥劑抑制菌絲生長的有效中濃度（EC50）作為毒力參數。

計算公式：抑制生長率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落凈生長量-接種菌柄直徑）×100%。

1.2.3 殺菌劑對葡萄炭疽病菌和白腐病菌的最佳配比離體試驗篩選

采用幾率值分析法計算每個殺菌劑對靶標菌菌絲生長的有效抑制中濃度，并通過下面公式計算混合藥劑的增效系數（SR）。

式中：a表示藥劑A在混合藥劑中所占的比例;b表示藥劑B在混合藥劑中所占的比例;EC50（Obs）為實際測定的混合藥劑對病原菌的抑制中濃度;EC50（exp）為混合藥劑對病原菌的理論抑制中濃度。通過上面2個公式計算得每個設定比例的配方的SR值，SR>1.5說明2種藥劑復配具有增效作用，0.5≤SR≤1.5說明2種藥劑之間復配具有相加作用，SR<0.5 表明2種藥劑為拮抗作用[13]。

1.2.4 殺菌劑對葡萄炭疽病和白腐病的田間防效試驗

1.2.4.1 試驗田概況

試驗于2016年在句容市戴家邊戴子龍葡萄園進行。葡萄品種為夏黑，栽培方式為棚架，樹齡為6年，田間管理水平良好，試藥前1周未使用其他農藥。

1.2.4.2 試驗設計

將肟菌酯、葉菌唑按質量比3 ∶1的比例加工成40%肟菌酯·葉菌唑懸浮劑。試驗共設40%肟菌酯·葉菌唑懸浮劑（江蘇擎宇化工科技有限公司）1 500、3 000、4 500倍液，10%葉菌唑懸浮劑（江蘇輝豐生物農業(yè)股份有限公司）1 500倍液，30%肟菌酯懸浮劑（江蘇耕耘化學有限公司）1 500倍液，設清水對照6個處理，每個處理4次重復，隨機區(qū)組排列，每個小區(qū)供試3株葡萄樹。

1.2.4.3 統計方法

于2016年6月15日，果穗分別用上述藥劑浸果處理，藥后2 h套袋，果實成熟后摘袋調查果實病害。每個處理隨機取5個果穗，調查并記錄每穗果粒數和發(fā)病果粒數，并計算發(fā)病果粒率和果粒防效。

葡萄炭疽病和白腐病以發(fā)病果粒率表示各處理的發(fā)病情況，結果計算公式：

發(fā)病果粒率=發(fā)病粒數/調查總果粒數×100%;

防治效果=（對照區(qū)病果率-處理區(qū)病果率）/對照區(qū)病果率×100%。

2 結果與分析

2.1 室內抑菌活性測定

2.1.1 葉菌唑與肟菌酯對葡萄炭疽病病菌和白腐病病菌菌絲生長的抑制作用

由表1可知，葉菌唑與肟菌酯的濃度分別為0.062 5～2 μg/mL和0.25～8 μg/mL時，對葡萄炭疽病抑菌率分別為2.12%～72.73%、17.88%～66.97%。當葉菌唑與肟菌酯的濃度分別為0.062 5～2 μg/mL 和0.312 5～10 μg/mL時，對葡萄白腐病抑菌率分別為5.45%～76.36%、15.76%～72.73%。這表明2種殺菌劑對葡萄炭疽病菌及白腐病菌菌絲生長的抑制活性以及對葡萄炭疽病菌及白腐病菌菌絲生長的最低抑制濃度有差異。

2.1.2 葉菌唑與肟菌酯復配對葡萄炭疽病病菌及白腐病菌菌絲生長的抑制作用

由表2可知，葉菌唑與肟菌酯5種混配組合的濃度為0.062 5～2 μg/mL時，3 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3和1 ∶5的配比復配組合對葡萄炭疽病病菌菌絲生長抑菌率分別為18.18%～76.36%、4.24%～72.73%、12.73%～70.91%、14.55%～75.15%、13.94%～71.21%。由表3可知，當葉菌唑與肟菌酯5種混配組合的濃度為 0.156 25～5 μg/mL時，3 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3和 1 ∶5 的配比復配組合對葡萄白腐病病菌菌絲生長抑菌率分別為15.45%～7879%、9.09%～79.39%、19.09%～84.24%、18.18%～83.64%、15.76%～78.18%。

2.1.3 葉菌唑、肟菌酯及其復配劑對葡萄炭疽病病菌和白腐病菌的毒力測定 2種單劑和5種復配組合對葡萄炭疽病病菌的作用模型如表4所示，濃度對數與防治效果幾率值的相關系數均≥0.960 4，說明防治效果幾率值的變異有96.04%或以上來自濃度對數的變異，表明用所得模型表達濃度對數與防治效果幾率值的關系可行。

由表4可知，葉菌唑、肟菌酯單劑對葡萄炭疽病病菌的EC50分別為0.898 3、3.670 7 μg/mL，葉菌唑對葡萄炭疽病菌菌絲生長的抑制活性高于肟菌酯。葉菌唑、肟菌酯單劑對葡萄白腐病病菌的EC50分別為0.838 6、3.395 5 μg/mL，葉菌唑對葡萄白腐病菌菌絲生長的抑制活性同樣也高于肟菌酯（表5）。

根據Wadley評價法，葉菌唑與肟菌酯對炭疽病病菌分別以質量比1 ∶1、1 ∶3、1 ∶2和1 ∶5的復配，增效系數（SR）分別為1.97、3.37、2.62、2.53，增效系數（SR）﹥1.5，表現出增效作用，質量比3 ∶1的復配，增效系數（SR）在0.5～1.5之間，表現出相加作用;葉菌唑與肟菌酯對白腐病病菌分別以質量比1 ∶3和1 ∶2的復配，增效系數（SR）分別為2.05和151，增效系數（SR）﹥1.5，表現出增效作用，質量比3 ∶1、1 ∶1 和 1 ∶5 的復配，增效系數（SR）在0.5～1.5之間，表現出相加作用;因此，葉菌唑和肟菌酯復配對葡萄炭疽病病菌及白腐病病菌的都有較高抑制作用，推薦最佳復配配比為 1 ∶3。其中，葉菌唑 ∶肟菌酯=1 ∶3的增效系數最高;葉菌唑 ∶肟菌酯=3 ∶1的增效系數最低。生產中可根據原藥的成本和實際使用效果確定合適的配比。

2.2 田間藥效試驗

由表6可知，40%肟菌酯·葉菌唑4 500倍液、3 000倍液、1 500倍液、10%葉菌唑1 500倍液、30%肟菌酯1 500倍液，成熟采收時（施藥后50 d）對葡萄炭疽病的防治效果分別為53.00%、64.35%、73.85%、68.87%、55.12%，40%肟菌 酯· 葉菌唑1 500倍液對葡萄炭疽病的防治效果極顯著高于30%肟菌酯1 500倍液，防治效果高于10%葉菌唑1 500倍液，但未達到顯著性差異。由表7可知，40%肟菌酯·葉菌唑4 500倍液、3 000倍液、1 500倍液、10%葉菌唑1 500倍液和30%肟菌酯1 500倍液施藥后50 d對葡萄白腐病的防治效果分別為74.29%、82.29%、90.94%、83.52%、59.45%;40%肟菌酯·葉菌唑3 000倍液對葡萄白腐病的防治效果極顯著高于30%肟菌酯1 500倍液，與10%葉菌唑1 500倍液防效相當;40%肟菌酯·葉菌唑1 500倍液對葡萄白腐病的防治效果極顯著高于30%肟菌酯1 500倍液和10%葉菌唑1 500倍液。

3 結論與討論

葡萄炭疽病和白腐病是葡萄的主要病害，在我國發(fā)生頻率較高，目前化學藥劑防治仍是葡萄炭疽病和白腐病防治的有效措施。甾醇對維系細胞膜結構，保持真核細胞結構的流動性十分重要[14]，三唑類殺菌劑是一種含有三氮唑的有機雜環(huán)類化合物，可通過三唑環(huán)上的N-4與真菌細胞色素p-450中的鐵卟啉中心的亞鐵離子配位，進而抑制其底物的脫甲基化反應，來阻斷麥角甾醇的合成，使真菌的細胞膜功能受到破壞，影響真菌菌絲或者是孢子的形成[15]。自第1個三唑類殺菌劑三唑酮面世以來，這類殺菌劑如三唑醇、戊唑醇、烯唑醇、丙環(huán)唑、腈菌唑、葉菌唑等陸續(xù)被開發(fā)，三唑類殺菌劑是現階段合成種類數最多的麥角甾醇合成抑制劑[14]。目前葉菌唑主要應用于禾本科作物防治白腐病、葉銹病、矮形銹病、穎枯病、黃銹病以及穗鐮刀菌、殼針孢菌等引起的病害[16]。陸學云研究發(fā)現，40%葉菌唑·戊唑醇水乳劑150 g/hm2對小麥赤霉病田間防效達97.2%[17]。葉菌唑在美國南卡羅來納州登記為防治桃樹病害的藥劑[14]，同時在美國被登記為防治蘋果白腐病和黑腐病的殺菌劑[18]。本研究發(fā)現，葉菌唑單劑對葡萄炭疽病病菌和白腐病菌的EC50僅為0.898 3、0.838 6 μg/mL。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑具有廣譜性和高殺菌活性的特點，其作用機制是抑制線粒體中的電子傳遞，破壞ATP的產生，最終導致病菌因失去能量而死。目前，已經商品化的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑主要有嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯和啶氧菌酯等。肟菌酯主要應用于大豆、谷物、玉米和葡萄等作物。肟菌酯對大多數真菌綱的病害具有良好的活性[19]，針對油菜菌核病其防效優(yōu)于多菌靈[20]。在美國西瓜炭疽病防治試驗中發(fā)現，肟菌酯增加了總果實數量和重量，提高了果實可溶性固形物含量，并降低了炭疽病癥狀的果實比例[21]。解維星等研究發(fā)現，30%肟菌酯·苯醚甲環(huán)唑水乳劑1 000倍液對黃瓜白粉病的防治效果好，第2次藥后 10 d 防效可達92.68%[12]。本研究結果表明，肟菌酯單劑對葡萄炭疽病菌和白腐病菌的EC50分別為3.670 7、3.395 5 μg/mL。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑如肟菌酯、嘧菌酯和吡唑醚菌酯等，如果長期使用，可能會存在一定的抗藥性隱患，將其與作用機制不同的其他種類殺菌劑混配可延緩或降低抗藥性的發(fā)生。不同種類殺菌劑復配產生的增效作用，不僅可以減少殺菌劑的用量，還可以提高殺菌劑的活性，降低農藥使用成本，減少對環(huán)境的污染[22]。本試驗得出，葉菌唑和肟菌酯以質量比 1 ∶3 的比例混合，在離體條件下對葡萄炭疽病和白腐病都具有增效作用，在田間條件下40%肟菌酯·葉菌唑 1 500 倍液對葡萄炭疽病和白腐病的平均果粒防效極顯著高于30%肟菌酯1 500倍液，對炭疽病的平均果粒防效與10%葉菌唑 1 500 倍液防效相當，對白腐病的平均果粒防效顯著高于10%葉菌唑1 500倍液，本研究結果為40%肟菌酯·葉菌唑 1 500 倍液應用于葡萄炭疽病和白腐病防治提供了依據，可在生產中進一步示范應用。

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