楊勇++王建華++吉沐祥++吳祥++陳宏州+李國(guó)平

摘要：為篩選防治葡萄灰霉病的高效低毒新型植物源復(fù)配殺菌劑，降低有效用藥量，提高防治效果，減少和替換對(duì)葡萄灰霉病菌產(chǎn)生抗藥性的一些常用化學(xué)殺菌劑。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定植物源農(nóng)藥丁子香酚、苦參堿及其混配制劑對(duì)葡萄灰霉病菌的毒力，并通過(guò)田間試驗(yàn)評(píng)價(jià)其對(duì)葡萄灰霉病的防治效果。結(jié)果表明，丁子香酚與苦參堿及 6 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]3、1 ∶[KG-*3]6混配組合對(duì)葡萄灰霉病菌的EC50（半最大效應(yīng)濃度）值分別為1.454 7、357.536 9、0.384 8、0.757 5、1.312 0、2.087 3、4.960 1 μg/mL；5種混配組合對(duì)葡萄灰霉病菌的增效系數(shù)（SR）分別為4.41、2.56、2.21、2.75、2.00，幾種配比均具有明顯增效作用，其中以6 ∶[KG-*3]1混配的組合增效系數(shù)最大。田間防效調(diào)查結(jié)果表明，0.5% 丁子香酚可溶液劑250倍液+1.3%苦參堿水劑500倍液（高濃度）、0.5%丁子香酚可溶液劑375倍液+1.3%苦參堿水劑750倍液（中濃度）、0.5%丁子香酚可溶液劑500倍液+1.3%苦參堿水劑1 000倍液（低濃度）、0.5%丁子香酚可溶液劑250倍液、1.3%苦參堿水劑500倍液對(duì)葡萄灰霉病防治效果分別為86.31%、67.03%、55.34%、8014%、57.73%。丁子香酚和苦參堿6 ∶[KG-*3]1～1 ∶[KG-*3]6混配對(duì)葡萄灰霉病菌均增效明顯，果穗套袋前采用0.5%丁子香酚可溶液劑250倍液+1.3%苦參堿水劑500倍液混用浸果處理后套袋，采收前調(diào)查對(duì)葡萄灰霉病害防效為85%以上，明顯優(yōu)于各單劑和中、低濃度混配處理的防效。

關(guān)鍵詞：葡萄灰霉?。欢∽酉惴?；苦參堿；復(fù)配；抑制活性；田間防效

中圖分類號(hào)：S436.631.1+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0160-04

收稿日期：2016-05-16

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技富民強(qiáng)縣專項(xiàng)（編號(hào)：BN20156222）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（14）2056]。

作者簡(jiǎn)介：楊勇（1990—），男，安徽宣城人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事果樹(shù)栽培與植保研究。Tel：（0511）80978060；E-mail：yl0656@163.com。

通信作者：吉沐祥，研究員，主要從事果樹(shù)植保與農(nóng)藥開(kāi)發(fā)研究。Tel：（0511）80978060；E-mail：jilvdun2800@163.com。

灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）引起的真菌病害，腐生性強(qiáng)、寄主廣泛，已報(bào)道的就超過(guò)200種。在葡萄生產(chǎn)上，灰霉病是常見(jiàn)病害，也是最嚴(yán)重的病害之一，每年因灰霉病造成的葡萄損失為20%左右，發(fā)病嚴(yán)重的果園損失高達(dá)50%[1]。該病主要侵染葡萄的花冠、花序、果實(shí)、葉片及新梢，同時(shí)也會(huì)對(duì)貯藏期的葡萄造成嚴(yán)重危害，如何有效控制灰霉病的發(fā)生成為葡萄產(chǎn)業(yè)的當(dāng)務(wù)之急。

目前對(duì)葡萄灰霉病的防治大多還是使用化學(xué)藥劑，然而灰葡萄孢菌具有高基因漂移潛力、種群尺度較大、繁殖速度快、遺傳變異大、適合度高[2-4]，加之用藥不科學(xué)，多年持續(xù)使用單一藥劑，造成灰霉病菌對(duì)一些殺菌劑（苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、氨基甲酸酯類）產(chǎn)生了抗藥性，甚至出現(xiàn)多重抗藥性，導(dǎo)致藥劑對(duì)葡萄灰霉病的田間防效大幅下降，給病害防治帶來(lái)很多困難[5-6]。灰霉病菌對(duì)苯并咪唑類、二甲酰亞胺類及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的多重抗藥性類型有RRS型（R表示抗，S表示感，RRS即為對(duì)前2類殺菌劑已有抗藥性而對(duì)后1類尚敏感）、RSS型、SSR型和RRR型，前人研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)各地區(qū)葡萄灰霉病菌對(duì)3類藥劑出現(xiàn)不同程度的抗藥性，對(duì)苯并咪唑類的抗藥性已普遍存在[7]。丁子香酚是存在于桃金娘科丁子香屬植物丁香（Eugenia caryophyllato Thunb）中的一種有香味的揮發(fā)性物質(zhì)。20世紀(jì)90年代，國(guó)內(nèi)首次將丁子香酚研發(fā)作為蔬菜等作物的殺菌劑[8]，作為治療性殺菌劑，丁子香酚具有殺菌譜廣、毒性低的特點(diǎn)，能迅速治療多種農(nóng)作物、水果感染的真菌、細(xì)菌性病害[9-11]，如灰葡萄孢菌、腐霉菌、鐮刀菌、雙疫霉菌等[12]?？鄥A是由苦參的根、莖、葉和果實(shí)經(jīng)乙醇等有機(jī)溶劑提取制成，主要成分為生物堿和黃酮類，被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)逐漸開(kāi)發(fā)出苦參堿農(nóng)藥，應(yīng)用于防治果蔬、茶葉、煙草等作物的病蟲(chóng)害，并取得了良好防效[13]。[JP2]丁子香酚與苦參堿作用機(jī)理各異，2種藥劑復(fù)配既具有保護(hù)作用又具有治療作用，或許有利于克服或延緩葡萄灰霉病菌抗藥性的發(fā)展，提高防治效果。為了進(jìn)一步明確丁子香酚和苦參堿混配對(duì)控制葡萄灰霉病菌是否具有增效作用，本試驗(yàn)進(jìn)行了丁子香酚和苦參堿的混合物聯(lián)合毒力測(cè)定，通過(guò)田間藥效試驗(yàn)評(píng)價(jià)了2種制劑混用對(duì)葡萄灰霉病的防治效果，旨在明確丁子香酚與苦參堿混配對(duì)葡萄灰霉病的毒力及合理配比，以及田間對(duì)葡萄果穗灰霉病的實(shí)際防效，為減少和替代化學(xué)農(nóng)藥，防止化學(xué)抗藥性和殘留，提高果品安全品質(zhì)，尋求有效防治葡萄灰霉病的生物產(chǎn)品提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1室內(nèi)抑菌活性測(cè)定

1.1.1試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)于2014年4—7月在江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究室實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.2供試菌株葡萄灰霉病菌，采自江蘇省句容市華陽(yáng)鎮(zhèn)葡萄園，由江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植保研究室分離、鑒定、保存?zhèn)溆谩＞瓯４嬗隈R鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）斜面上（4 ℃）。

1.1.3供試藥劑20%丁子香酚（eugenol）水劑（江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司）；5%苦參堿（matrine）母藥（北京三浦百草綠色植物制劑有限公司）；1.3%苦參堿水劑（山西德威生化有限責(zé)任公司）；0.3%丁子香酚可溶液劑（江蘇省南通神雨綠色藥業(yè)有限公司）。

1.1.4儀器設(shè)備電子天平（感量0.1 mg）、GZP-300A培養(yǎng)箱、直徑為75 mm的培養(yǎng)皿、三角瓶、移液器、移液管、洗耳球、打孔器、接種刀等。

1.1.5試驗(yàn)方法

1.1.5.1藥液的配制及濃度設(shè)計(jì)（1）母液配制：將20%丁子香酚水劑和5%苦參堿母藥用適量丙酮溶解后加10%吐溫80，配制成1 000 μg/mL母液置于4 ℃冰箱中備用。

（2）各藥劑單劑與復(fù)配劑的濃度設(shè)計(jì)：丁子香酚在含藥PSA培養(yǎng)基中的有效成分濃度設(shè)計(jì)為：50.000 000、25.000 000、12.500 000、6.250 000、3.125 000、1.562 500、0.781 250、0390 625 μg/mL；苦參堿在含藥PSA培養(yǎng)基中的有效成分濃度設(shè)計(jì)為：100.000 00、50.000 00、25.000 00、12.500 00、6.250 00、3.125 00、1.562 50、0.781 25 μg/mL；丁子香酚 ∶[KG-*3]苦參堿（6 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]3和1 ∶[KG-*3]6）混配在含藥PSA中的有效成分濃度設(shè)計(jì)均為：50.000 000、25.000 000、12.500 000、6.250 000、3.125 000、1.562 500、0.781 250、0.390 625 μg/mL。單劑與混配劑的有效成分濃度設(shè)計(jì)均為7個(gè)不同濃度梯度含藥PSA培養(yǎng)基。

除母液外，所有試驗(yàn)藥劑系列有效成分濃度的藥液均為現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.5.2殺菌劑對(duì)葡萄灰霉病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定采用菌絲生長(zhǎng)速率法[14]，將各單劑與混配劑的藥液依次稀釋至所需濃度，然后將1 mL藥液與9 mL培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿內(nèi)混勻，制成含系列濃度藥劑的PSA培養(yǎng)基，采用無(wú)菌水作空白對(duì)照，各處理重復(fù)4次。將保留的葡萄灰霉病菌轉(zhuǎn)接到PSA平皿中，在25 ℃下活化72 h，然后在近菌落邊緣用打孔器制取直徑為5 mm的菌餅，并轉(zhuǎn)接到含藥的PSA平皿和空白對(duì)照中。25 ℃ 培養(yǎng)96 h，待對(duì)照中菌落約長(zhǎng)至平皿直徑的4/5時(shí)，采用十字交叉法量取菌落直徑。

計(jì)算菌落直徑均值，并按照下列公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)平均抑制率：

菌絲生長(zhǎng)平均抑制率=[（對(duì)照菌落直徑均值-處理菌落直徑均值）/（對(duì)照菌落直徑均值-接種菌餅直徑）]×100%。取抑制率在5%～95%的數(shù)據(jù)，采用DPS 13.0專業(yè)版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出藥劑對(duì)葡萄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)抑制的回歸方程、EC50及其95%置信限。

1.1.5.3聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法根據(jù)Wadley法[14]，計(jì)算增效系數(shù)（SR）。根據(jù)增效系數(shù)評(píng)價(jià)藥劑混用的聯(lián)合作用類型，即SR<0.5為拮抗作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR>1.5為增效作用。

[JZ（]SR=EC50（Eth）/EC50（Eob）；[JZ）][JY]（1）

[JZ（]EC50（Eth）=（a+b）/[（a/EC50A）+（b/EC50B）]。[JZ）][JY]（2）

式中：A、B分別為丁子香酚和苦參堿單劑；EC50A、EC50B分別為丁子香酚和苦參堿單劑的EC50值；a、b分別為丁子香酚和苦參堿單劑在混劑中的比例；EC50（Eth）為混劑EC50理論值；EC50（Eob）為混劑EC50實(shí)測(cè)值。

1.2殺菌劑對(duì)葡萄灰霉病的田間防效試驗(yàn)

田間試驗(yàn)于2015年在句容市華陽(yáng)鎮(zhèn)下甸村農(nóng)戶葡萄園進(jìn)行，葡萄品種為夏黑，樹(shù)齡5年，栽培方式為籬架。試驗(yàn)設(shè)0.5%丁子香酚可溶液劑250倍液+1.3%苦參堿水劑500倍液、0.5%丁子香酚可溶液劑375倍液+1.3%苦參堿水劑750倍液、0.5%丁子香酚液500倍液+1.3%苦參堿1 000倍液（以下分別簡(jiǎn)稱高濃度、中濃度、低濃度）、0.5%丁子香酚250倍液、1.3%苦參堿500倍液及清水對(duì)照6個(gè)處理，每處理重復(fù)3次，隨機(jī)區(qū)組排列，每小區(qū)供試葡萄樹(shù)3株。

果粒直徑約為1 cm時(shí)選擇晴好天氣上午浸果處理，當(dāng)天下午套袋，果實(shí)成熟后摘袋調(diào)查病果率。每個(gè)處理取10個(gè)果穗，記錄調(diào)查總果粒數(shù)、病果粒數(shù)，計(jì)算病果率及防治效果。

葡萄灰霉病以病果率表示各處理區(qū)的發(fā)病情況。

[JZ]病果率=（病果數(shù)/調(diào)查總果數(shù)）×100%；

防治效果=（對(duì)照區(qū)病果率-處理區(qū)病果率）/對(duì)照區(qū)病果率×100%。[JY]（3）

2結(jié)果與分析

2.1室內(nèi)抑菌活性測(cè)定研究

2.1.1丁子香酚與苦參堿對(duì)葡萄灰霉病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用從表1可看出，當(dāng)丁子香酚的濃度為0.390 625～50.000 000 μg/mL時(shí)，對(duì)葡萄灰霉病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率為 29.15%～93.47%；當(dāng)苦參堿藥劑處理濃度為0.781 25～100.000 00 μg/mL 時(shí)，對(duì)葡萄灰霉病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率為 6.03%～38.19%。這表明2種殺菌劑對(duì)葡萄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性以及對(duì)葡萄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的最低抑制濃度（MIC值） 有差異。

2.1.2丁子香酚與苦參堿混配對(duì)葡萄灰霉病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用從表2可看出，丁子香酚與苦參堿混配組合不同處理濃度對(duì)灰霉病菌表現(xiàn)不同程度的抑制作用。丁子香酚與苦參堿5種混配組合的濃度為0.390 625～50.000 000 μg/mL 時(shí)，6 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]3和1 ∶[KG-*3]6配比的混配組合對(duì)葡萄灰霉病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率分別為5276%～91.46、44.22%～90.45%、34.67%～87.44%、2613%～84.92%、18.09%～81.41%。表明丁子香酚與苦參堿混配組合不同處理濃度對(duì)葡萄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性和最低抑制濃度（MIC值）有較大差異。

2.1.3丁子香酚、苦參堿及其混配劑對(duì)葡萄灰霉病病菌的毒力測(cè)定2種單劑和5種復(fù)配組合對(duì)葡萄灰霉病病菌的作用模型見(jiàn)表3，濃度對(duì)數(shù)與防治效果概率值的相關(guān)系數(shù)均 ≥0.991 7，說(shuō)明防治效果概率值的變異有99.17%或以上來(lái)自濃度對(duì)數(shù)的變異，[JP2]表明用所得模型表達(dá)濃度對(duì)數(shù)與防治效果概率值的關(guān)系可行。表3數(shù)據(jù)表明，丁子香酚、苦參堿單劑對(duì)葡萄灰霉病病菌的EC50分別為1.454 7、357.536 9 μg/mL，丁子香酚對(duì)葡萄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性高于苦參堿。從表3中也可看出，丁子香酚與苦參堿分別以質(zhì)量比6 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]3 和1 ∶[KG-*3]6混配后對(duì)葡萄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)抑制的EC50分別為0.384 8、0.757 5、1.312 0、2.087 3、4.960 1 μg/mL，丁子香酚與苦參堿分別以質(zhì)量比6 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]1和1 ∶[KG-*3]1混配后對(duì)灰霉病菌的抑制作用均強(qiáng)于各單劑；5種混配組合對(duì)葡萄灰霉病菌的增效系數(shù)（SR）分別為4.41、2.56、2.21、2.75和 2.00，根據(jù) Wadley評(píng)價(jià)法，增效系數(shù)（SR）均大于1.5，表現(xiàn)出增效作用，其中以質(zhì)量比6 ∶[KG-*3]1混配，增效系數(shù)（SR）最高，為4.41。因此，從整體上判斷丁子香酚和苦參堿混配劑對(duì)葡萄灰霉病病菌的抑制作用較好，并且推薦的最佳混配比為 6 ∶[KG-*3]1。

2.2田間防治效果試驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證丁子香酚和苦參堿混用組合對(duì)葡萄灰霉病的防治效果，特進(jìn)行了田間防治效果試驗(yàn)。從藥后50 d采摘前調(diào)查對(duì)葡萄灰霉病病粒防治效果（表4）可以看出，混用組合高濃度防效為86.31%，顯著高于2個(gè)單劑和混用組合中濃度及低濃度，而0.5%丁子香酚可溶液劑250倍液?jiǎn)蝿?duì)灰霉病的防效也達(dá)到了80%以上，顯著高于混合組合中、低濃度。因此，葡萄灰霉病防治效果，以高濃度混用組合最優(yōu)，0.5%丁子香酚可溶液劑250倍液對(duì)套袋前浸果處理也有較好防效。

2.3安全性調(diào)查

套袋前浸果處理施藥后的10、30、50 d（采收時(shí)）拆袋目測(cè)觀察，各處理區(qū)葡萄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育正常，無(wú)明顯藥害或藥斑，表明供試藥劑在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)對(duì)葡萄果穗安全。

[BT1#]3結(jié)論與討論

灰霉病是廣泛分布于全世界葡萄種植國(guó)家和地區(qū)的重要病害，它嚴(yán)重影響了葡萄的產(chǎn)量和質(zhì)量。傳統(tǒng)防治灰霉病的藥劑如腐霉利、嘧霉胺、多菌靈、百菌清等由于使用頻繁，灰霉病菌部分藥劑已產(chǎn)生抗藥性，防效較差。嚴(yán)紅等通過(guò)檢測(cè)葡萄灰霉病菌對(duì)苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、氨基甲酸酯類殺菌劑的抗藥性發(fā)現(xiàn)，葡萄灰霉病菌對(duì)多菌靈的抗藥性嚴(yán)重，為83.5%，對(duì)腐霉利和乙霉威的抗藥性頻率分別為14.7%和17.4%，[JP2]抗藥性處于發(fā)展階段[7]。張瑋等研究表明，中國(guó)葡萄灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗藥性頻率為22.22%～62.50%，抗藥性普遍，并與多菌靈、腐霉利、乙霉威均存在交互抗藥性[15]。

本研究采用室內(nèi)毒力測(cè)定與田間藥效試驗(yàn)相結(jié)合的方法，測(cè)試了丁子香酚、苦參堿及其混配組合對(duì)葡萄灰霉病的防治效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)室內(nèi)毒力測(cè)定，丁子香酚和苦參堿對(duì)葡萄灰霉病菌均具有抑菌活性，其中丁子香酚對(duì)葡萄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性明顯高于苦參堿。在單劑毒力的基礎(chǔ)上，結(jié)合不同殺菌劑的作用機(jī)理，選擇丁子香酚和苦參堿進(jìn)行不同配比的毒力測(cè)定。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5個(gè)配比（6 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]3、1 ∶[KG-*3]6）均表現(xiàn)為明顯增效作用，其中丁子香酚、苦參堿6 ∶[KG-*3]1混配對(duì)葡萄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性最好，增效作用最高。將篩選出的新型混劑進(jìn)行田間小區(qū)試驗(yàn)，將丁子香酚和苦參堿進(jìn)行不同稀釋倍數(shù)混配處理。結(jié)果表明，0.5% 丁子香酚250倍液+1.3%苦參堿500倍液，對(duì)葡萄灰霉病的防效達(dá)到了85%以上，室內(nèi)毒力測(cè)定與田間藥效試驗(yàn)結(jié)果基本相符，室內(nèi)表現(xiàn)抑菌效果較好的混配劑組合在田間防效最高。在試驗(yàn)濃度條件下浸果處理該藥劑對(duì)葡萄果穗安全，無(wú)藥害發(fā)生。因此，丁子香酚和苦參堿混配可作為生產(chǎn)上防控葡萄灰霉病的植物源新藥劑。

由此可見(jiàn)，植物源農(nóng)藥丁子香酚和苦參堿復(fù)配或混用防治葡萄灰霉病可行，研究結(jié)果為生產(chǎn)中減少和替代化學(xué)農(nóng)藥，減少化學(xué)農(nóng)藥殘留和提高葡萄安全品質(zhì)提供了試驗(yàn)依據(jù)，從而為葡萄病害的防治提供了新方法，具有較好的應(yīng)用前景，但在對(duì)葉部和花穗灰霉病及其他病害防治等方面還有待進(jìn)一步研究。

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