鄭雪凌 崔向珍

【摘要】酶作為生物體內(nèi)的催化劑，具有高效性和高特異性的特點(diǎn)。但在工業(yè)生產(chǎn)中，酶穩(wěn)定性差、易流失，造成成本過(guò)高，限制其廣泛應(yīng)用。因此將酶采用固定化技術(shù)，使酶在發(fā)揮其高效、專一性同時(shí)，還能增強(qiáng)酶的貯存穩(wěn)定性，提高了生產(chǎn)效率，節(jié)約了成本。本文對(duì)酶和細(xì)胞的固定化技術(shù)進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】酶 細(xì)胞 固定化 載體 應(yīng)用

酶及細(xì)胞固定化技術(shù)是生物技術(shù)的重要組成部分。20世紀(jì)60年代出現(xiàn)了固定化酶技術(shù)，60年代末固定化酶技術(shù)用于工業(yè)生產(chǎn)，70年代出現(xiàn)了固定化細(xì)胞技術(shù)，80年代又發(fā)展了固定化增殖細(xì)胞技術(shù)以及包括輔助因子在內(nèi)的固定化多酶反應(yīng)體系技術(shù)。工程技術(shù)日益成熟，成為近代工業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的組成部分。

所謂固定化技術(shù)，是指利用化學(xué)或物理手段將游離的酶或細(xì)胞（微生物），定位于限定的空間區(qū)域并使其保持活性和可反復(fù)使用的一種基本技術(shù)，包括固定化酶技術(shù)和固定化細(xì)胞技術(shù)。固定化細(xì)胞的制備方法是多種多樣的，任何一種限制細(xì)胞自由流動(dòng)的技術(shù)，都可以用于制備固定化細(xì)胞。一般來(lái)說(shuō)，固定化技術(shù)大致可以分成吸附法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法等4大類，其中以包埋法使用最為普遍。

一、固定化技術(shù)分類

1.吸附法

很多細(xì)胞都有吸附到固體物質(zhì)表面的能力，這種吸附能力可以是天生具有的，也可以是經(jīng)過(guò)處理誘導(dǎo)產(chǎn)生的，依靠這種吸附能力，人們發(fā)展起許多廉價(jià)而又有效的固定化方法。吸附法可分為物理吸附法和離子吸附法，前者是使用具有高度吸附能力的硅膠、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纖維素等吸附劑將細(xì)胞吸附到表面上使之固定化，是一種最古老的方法，操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、載體可以反復(fù)利用，但結(jié)合不牢固，細(xì)胞易脫落。后者根據(jù)細(xì)胞在解離狀態(tài)下可因靜電引力（即離子鍵合作用）而固著于帶有相異電荷的離子交換劑上，如DEAE-纖維素、DEAE-Sephadex、CM-纖維素等。

2.共價(jià)結(jié)合法

共價(jià)結(jié)合法是細(xì)胞表面上功能團(tuán)和固相支持物表面的反應(yīng)基團(tuán)之間形成化學(xué)共價(jià)鍵連接，從而成為固定化細(xì)胞。該法細(xì)胞與載體之間的連接鍵很牢固，使用過(guò)程中不會(huì)發(fā)生脫落，穩(wěn)定性好，但反應(yīng)條件激烈、操作復(fù)雜、控制條件苛刻。有人用此法將卡爾酵母固定在已活化的多孔玻璃珠上，雖然細(xì)胞已經(jīng)死亡，但仍然保留生產(chǎn)尿酐酸的活性。利用此法制備的固定化細(xì)胞，細(xì)胞大多死亡。

3.交聯(lián)法

交聯(lián)法與共價(jià)結(jié)合法一樣，都是靠化學(xué)結(jié)合的方法使細(xì)胞固定化。如采用戊二醛或偶聯(lián)苯胺等帶有兩個(gè)以上的多功能團(tuán)交聯(lián)劑與細(xì)胞進(jìn)行交聯(lián)，可形成固定化細(xì)胞，但反應(yīng)條件激烈，對(duì)細(xì)胞活性影響大。千煙一郎曾用此法制得具有天冬氨酸酶活力的固定化大腸桿菌細(xì)胞，也有人用此法制得具有葡萄糖異構(gòu)酶活力的固定化細(xì)胞。

4.包埋法

包埋法是細(xì)胞固定化最常用的方法。按照包埋材料的結(jié)構(gòu)可分為凝膠包埋和微膠囊包埋，即將細(xì)胞包裹于凝膠的微小格子內(nèi)或半透膜聚合物的超濾膜內(nèi)。該方法操作簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞活性影響較小，制作的固定化細(xì)胞顆粒的強(qiáng)度較高，目前被廣泛地用于廢水處理。

四種固定化方法各有所長(zhǎng)，其中包埋法是相對(duì)較好的一種方法，幾種方法聯(lián)用，往往效果更好。無(wú)論采用何種方法，固定化酶的穩(wěn)定性是首要考慮的因素。酶、載體及試劑的費(fèi)用、操作難易等與工業(yè)化有關(guān)的因素也必須考慮?？蒲腥藛T在研究時(shí)，應(yīng)盡量選用價(jià)格低廉、易得的載體和試劑，載體最好是已在其他工業(yè)生產(chǎn)中大量使用的材料，同時(shí)也要考慮其應(yīng)用時(shí)的安全性。

二、固定化細(xì)胞（酶）載體的特性

一種較為理想的固定化載體應(yīng)滿足5個(gè)要求：①固定化酶或細(xì)胞的活性回收率要高;②材料容易獲得;③價(jià)格便宜;④操作制備方便，能適用于大規(guī)模生產(chǎn);⑤有較高的機(jī)械強(qiáng)度，能較長(zhǎng)時(shí)間使用和重復(fù)使用。目前所采用的固定化細(xì)胞（酶）載體主要有瓊脂、明膠、海藻酸鈉、硅藻土、聚乙烯醇，這5種載體的特性和差別主要有以下幾個(gè)方面：

（1）在5種載體中，瓊脂機(jī)械強(qiáng)度極差，實(shí)用性低。

（2）明膠強(qiáng)度較低，內(nèi)部結(jié)構(gòu)緊密，傳質(zhì)性能較差。

（3）海藻酸鈉凝膠和聚乙烯醇凝膠機(jī)械強(qiáng)度較好。電鏡觀察表明內(nèi)部呈多孔結(jié)構(gòu)，對(duì)生物的毒性小，固定操作容易。兩者比較，聚乙烯醇凝膠的機(jī)械強(qiáng)度優(yōu)于海藻酸鈉凝膠，但海藻酸鈉凝膠的傳質(zhì)性能比聚乙烯醇凝膠好。

三、固定化技術(shù)的生物反應(yīng)器

最簡(jiǎn)單的生物反應(yīng)器為分批式反應(yīng)器，制作這種反應(yīng)器只需要加入游離酶或固定化酶（細(xì)胞），使之懸浮于攪拌罐中，而不需要支持性裝置。反應(yīng)結(jié)束后只需離心或過(guò)濾，便可從中分離出酶。這種反應(yīng)器適合各種反應(yīng)，設(shè)備成本低，但固定化酶（細(xì)胞）在回收過(guò)程中易損失，因此工業(yè)規(guī)模應(yīng)用較少，對(duì)小規(guī)模試驗(yàn)合適。

另一種生物反應(yīng)器是連續(xù)流反應(yīng)器，即將粉狀、塊狀固定化酶（細(xì)胞）制成酶（細(xì)胞）柱，通入底物溶液，產(chǎn)物便可連續(xù)流出。連續(xù)流反應(yīng)器比分批式反應(yīng)器工作固定，減少操作費(fèi)用，易于自動(dòng)控制和掌握產(chǎn)品的質(zhì)量。

最新研制出了一種新型膜反應(yīng)器。這種反應(yīng)器應(yīng)用一定的半透膜或超過(guò)濾膜，游離酶在膜的一側(cè)或固定在膜上，酶反應(yīng)可連續(xù)進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)半透膜濾去，消除了產(chǎn)物對(duì)酶反應(yīng)的抑制，使酶反應(yīng)不斷沿著生成產(chǎn)物的方向進(jìn)行，并且不需乳化便可進(jìn)行兩相反應(yīng)。

四、展望

目前，固定化技術(shù)已在食品工業(yè)、精細(xì)化學(xué)品工業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用，在廢水處理方面也取得了一定進(jìn)展。用固定化技術(shù)生產(chǎn)化工產(chǎn)品，條件溫和，無(wú)三廢產(chǎn)生，隨著人類對(duì)環(huán)保的日益關(guān)注，固定化應(yīng)用會(huì)更受關(guān)注，如何充分利用天然高分子載體，對(duì)其改性，或利用納米技術(shù)、膜技術(shù)等來(lái)進(jìn)行固定，必定會(huì)成為研究的熱點(diǎn)。同時(shí)，開(kāi)發(fā)新型、高效固定化反應(yīng)器，進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)能力，也是未來(lái)研究的重點(diǎn)。而固定化酶（細(xì)胞）在各行業(yè)的應(yīng)用研究也必將推動(dòng)酶固定化技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。

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