崔向珍 鄭雪凌 孫靜 丁新麗

【摘要】本文建立快速靈敏的HPLC-MS/M方法測定血漿和組織中去甲斑蝥素鈉的濃度，研究去甲斑蝥素鈉小鼠體內組織分布。

【關鍵詞】去甲斑蝥素鈉 體內組織 分布

1實驗方法

1.1儀器與試藥

儀器Agilent 1200 Series/6410 Series HPLC/MS/MS高效液相色譜/質譜儀（安捷倫科學技術公司）;梅特勒-托利多AX -205電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;PROIND離心機（賀立氏）;XW-80A型旋渦混合器（上海精科實業(yè)有限公司）;PK514BP超聲清洗器（德國BANDEL），BHW-IV型電熱恒溫水溫箱（北京醫(yī)療設備廠）。

藥品 去甲斑蝥素鈉，實驗室自制，純度99.4%;去甲斑蝥素標準品由山東莒南制藥廠提供;利巴韋林標準品（純度），中國藥品生物制品檢定所。

試劑乙腈，批號501287;乙酸銨，批號110020;甲酸，批號406014;丙酮，批號405160均為色譜純，美國TEDIA COMPANY，INC生產(chǎn)。

標準溶液的制備 去甲斑蝥素鈉和利巴韋林儲備液及標準系列的配制同前。

1.2實驗動物

昆明種小白鼠，體重25±2克，雌雄各半，購于山東大學實驗動物中心。

1.3實驗設計

于給藥后0.25，1，2，4，8 h經(jīng)摘眼球取血后脫頸處死小鼠，取出心、肝、脾、肺、腎、腦、腸、胃、睪丸/子宮，組織用生理鹽水沖洗干凈后用濾紙吸干，-20℃保存待測。

1.4樣本分析

色譜條件C18色譜柱（150×4.6 mm，5 （m）;流動相乙腈-水（20：80，2 mM乙酸銨，含0.1%甲酸）;在線脫氣，流速1.0 mL·min-1;柱溫25℃;進樣量10μL。

質譜條件 AP-ESI離子源，正離子模式，干燥氣（N2）流速12.0 L·min-1，干燥氣壓力50 psi，干燥氣溫度為350℃，毛細管電壓4000 V，多級反應監(jiān)測（MRM）模式，選擇性離子對（M/Z）為169→123（去甲斑蝥素鈉）和267.1→135.1（內標利巴韋林），碎片電壓分別為120 V和170 V，碰撞能分別為5 eV和13eV。

組織樣品處理 取動物臟器，精密稱重，剪碎后按2 mL·g-1比例加入生理鹽水，冰浴條件下用組織勻漿機進行勻漿。取組織勻漿液0.3 mL，置離心管中，加10 （g·mL-1利巴韋林溶液30 （L（心、脾、腦組織加1 （g·mL-1利巴韋林溶液30 （L），渦旋30秒，加入100 （L 1MHCl，渦旋30秒，然后加入1 mL丙酮渦旋1 min，5000r·min-1離心10 min，取上清液1 mL置離心管中，40℃氮氣吹干，殘留物用100 （L水復溶，取10 （L進樣測定。

1.5數(shù)據(jù)處理

組織分布參數(shù)計算根據(jù)計算得到的組織中藥物濃度-時間數(shù)據(jù)，計算藥時曲線下面積AUC，MRT，結合Cmax、Tmax等參數(shù)考察藥物在體內組織分布情況及動力學過程。

2結果

2.1組織稱重及處理

將給藥后0.25，1，2，4，8 h采集的組織樣本經(jīng)生理鹽水沖洗，濾紙吸干后用電子天平精密稱量，稱重原始數(shù)據(jù)。

2.2小鼠組織中去甲斑蝥素鈉濃度-時間數(shù)據(jù)

根據(jù)HPLC-MS/MS法測定得到的組織中去甲斑蝥素鈉的濃度和精密稱量的組織重量，計算每克組織中藥物含量（μg·g-1）=C測×V/W稱，其中C測為測定得到組織勻漿中去甲斑蝥素鈉濃度（μg·mL-1）;V為所加生理鹽水體積（mL）;W稱為組織重量。

由結果看出，小鼠灌胃給予去甲斑蝥素鈉溶液后，在各組織中分布廣泛，給藥后不同時間點各組織中藥物濃度依次為：0.25h，小腸>子宮>胃>腎>睪丸>肝>肺>心>脾>腦;1h，胃>小腸>子宮>腎>肝>睪丸>肺>心>脾>腦;2h，小腸>胃>子宮>腎>睪丸>肝>脾>肺>心>腦;4h，腎>小腸>肝>子宮>胃>睪丸>肺>心>脾>腦;8 h，小腸>子宮>胃>肝>睪丸>腎>肺>脾>心>腦。

2.3組織中藥物濃度-時間分布圖

根據(jù)各組織平均濃度-時間數(shù)據(jù)繪制組織中藥物濃度-時間分布圖。

由結果可知，除脾臟是1 h達峰外，去甲斑蝥素鈉在其他組織均在15 min達到最高濃度，然后隨時間逐漸降低;給藥后4 h，在心、肝、肺、腎的濃度再次升高，隨后降低;而腦、胃、睪丸、子宮隨時間濃度逐漸降低。

去甲斑蝥素鈉在腸、胃和子宮的分布最高，腎和睪丸次之，在心、肝、脾和肺的分布較低，腦中藥物量極低。

2.4組織藥-時曲線下面積和平均滯留時間數(shù)據(jù)

根據(jù)DAS 2.0計算小鼠灌服去甲斑蝥素鈉溶液后各組織藥-時曲線下面積（AUC）和平均滯留時間（MRT），以AUC為指標進一步分析去甲斑蝥素鈉在小鼠組織的分布，以MRT為指標分析去甲斑蝥素鈉在小鼠組織的消除情況。

由結果可知，給藥后各組織藥時曲線下面積依次為：小腸>胃>子宮>腎>睪丸>肝>肺>脾>心>腦。給藥后各組織體內平均滯留時間依次為：肺>肝>睪丸>腦>脾>腎>子宮>心>胃>小腸。

3討論

給藥后各組織藥時曲線下面積依次為：小腸>胃>子宮>腎>睪丸>肝>肺>脾>心>腦。給藥后各組織體內平均滯留時間依次為：肺>肝>睪丸>腦>脾>腎>子宮>心>胃>小腸。由此可以看出，去甲斑蝥素鈉在胃、小腸等消化道組織中分布最高，為其在消化道癌癥的臨床應用提供藥動學理論依據(jù);其次，子宮中去甲斑蝥素鈉的分布較多，體外實驗證實去甲斑蝥素對宮頸癌（HeLa）具有較強的抗癌作用，但臨床在子宮癌或宮頸癌的應用較少，可以此為理論基礎增加其臨床適應癥;去甲斑蝥素鈉在腎中的分布仍較高，臨床表現(xiàn)為泌尿系統(tǒng)刺激性;去甲斑蝥素鈉在臨床主要用于肝癌的治療，但實驗結果表明肝中去甲斑蝥素鈉的濃度較低;藥物在睪丸、肺、脾、心和腦的分布較低，特別是腦組織中的濃度極低，說明其不易透過血腦屏障，與其極性大、脂溶性低有關。

給藥后各組織體內平均滯留時間依次為：肺>肝>睪丸>腦>脾>腎>子宮>心>胃>小腸，其在肺和肝中的滯留時間較長，消除比較慢，可以增強藥物的療效，因此臨床常用于肝癌的治療。

從兩項結果可以看出，去甲斑蝥素鈉在分布較高組織滯留時間較短，分布較低的組織滯留時間較長，決定其在臨床上作用廣泛。

參考文獻：

[1]董成.3H-去甲基斑蝥素在小鼠體內分布的研究[J].江西醫(yī)學院學報，1984（1）：24-25.

[2]魏春敏，王本杰，馬婭等.3H-去甲斑蝥素小鼠體內藥代動力學與組織分布[J]. 藥學學報，2007，42（5）：516–519.