孫曉玲， 張曉娟， 張清泉， 邱雷， 王林娜， 侯素平

哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院病理科(河北衡水 053000)

Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤是一種呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的低級(jí)別膠質(zhì)瘤。其在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中有較高發(fā)生率[1]。Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤部分會(huì)惡性進(jìn)展，若其發(fā)展為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等類(lèi)型，則會(huì)嚴(yán)重影響患者生命安全。有研究表明彌漫浸潤(rùn)性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤或者多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性進(jìn)展與腫瘤基因分子亞型不同有關(guān)[2]。彌漫浸潤(rùn)性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤后發(fā)生其增殖指數(shù)會(huì)發(fā)生一定變化，同時(shí)伴有重要功能分子缺失，諸多分子改變的特點(diǎn)均與基因分型密切相關(guān)，星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤基因分子表達(dá)差異對(duì)分子靶點(diǎn)藥物研發(fā)有重要意義，是目前臨床重點(diǎn)關(guān)注的課題。因此，本研究通過(guò)對(duì)收治的57例Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)惡性變標(biāo)本的相關(guān)分子特點(diǎn)進(jìn)行回顧性分析，旨在通過(guò)基因分子亞型探索為臨床制定Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)惡性變治療方案提供依據(jù)。具體報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年7月至2018年8月收治的57例Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者。根據(jù)臨床進(jìn)程不同將患者均分為3組(未復(fù)發(fā)組、復(fù)發(fā)進(jìn)展組以及復(fù)發(fā)無(wú)進(jìn)展組)。57例患者家屬均對(duì)本研究知情并簽署知情協(xié)議書(shū)，本研究獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。未復(fù)發(fā)組患者共有20例，患者年齡42～72歲，平均(55.38±5.36)歲，男14例，女6例。膠質(zhì)瘤進(jìn)展組共有19例，患者年齡41～73歲，平均(53.28±4.67)歲，男12例，女7例。膠質(zhì)瘤無(wú)進(jìn)展組共有18例，患者年齡41～73歲，平均(55.46±4.82)歲，男10例，女8例。3組患者資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均在手術(shù)時(shí)經(jīng)過(guò)組織學(xué)診斷[3]；(2)臨床資料完整具有可溯性；(3)均為非初診病例；(4)首診均為本院；(5)均為本院同一團(tuán)隊(duì)施術(shù)者。其中，未復(fù)發(fā)組納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料顯示患者行手術(shù)切除后醫(yī)院持續(xù)隨訪5年，患者未復(fù)發(fā)。膠質(zhì)瘤進(jìn)展組納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料顯示腫瘤切除后腫瘤復(fù)發(fā)，判斷依據(jù)為影像學(xué)檢查、再次手術(shù)發(fā)現(xiàn)于原手術(shù)部位重新長(zhǎng)出腫瘤。術(shù)后病理證實(shí)腫瘤進(jìn)展為Ⅲ或Ⅳ級(jí)，為惡性病變。復(fù)發(fā)無(wú)進(jìn)展組納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病理證實(shí)腫瘤進(jìn)展為Ⅱ級(jí)改變。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床資料不全者；(2)惡性腫瘤者。

1.3 儀器與試劑 CX31光學(xué)顯微鏡(購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司)、數(shù)碼相機(jī)(上海歌凡生物科技有限公司)。5415 D離心機(jī)(購(gòu)自Gibco公司。EPS-300穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。電子天平(品牌：GB303，產(chǎn)地：美國(guó))。鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。兔抗人單克隆抗體試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司。兔抗人單克隆抗體購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司。生物素標(biāo)記二抗工作液購(gòu)自Peprotech公司。分析純二甲苯購(gòu)自上海研生實(shí)業(yè)有限公司。p21、Ki-67、p27測(cè)序反應(yīng)試劑均購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。DNA Marker DL 2000由美國(guó)Thermo Forma公司提供。

1.4 免疫與組化染色步驟 選取57例Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤切取組織標(biāo)本作為觀察對(duì)象，第一步57例Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤標(biāo)本中性甲醛溶液脫水固定；第二步為常規(guī)石蠟包埋。下一步為切片、免疫組化染色、10%過(guò)氧化氫室溫處理10 min、蒸餾水洗、PBS洗、孵育且之后PBS洗、蘇木素染細(xì)胞核。采用SP兩步法進(jìn)行免疫組化染色(染色強(qiáng)度評(píng)分共3分，無(wú)著色為0分，低度染色計(jì)1分，3分為重度著色；陽(yáng)性判斷指標(biāo)以細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核著色即顯示為棕色為陽(yáng)性)。將57例Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的cDNA與不同稀釋度的p21、Ki-67、TP53定植品按參考文獻(xiàn)[4]的反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。mRNA 的表達(dá)(反向引物為5′-TCAGACACCTTGCAGACCAG-3′；β-actin 作為內(nèi)參照，正向引物為5′-ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATC-3′，反向引物為5′-ATCCTTCTGACCCATGCCCACCA-3′)、構(gòu)建PCR反應(yīng)體系、分析mRNA相對(duì)表達(dá)量。標(biāo)本中的p21、Ki-67、TP53基因的拷貝數(shù)根據(jù)擴(kuò)增曲線以及標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。經(jīng)過(guò)計(jì)算得出p21、Ki-67、TP53單位質(zhì)量的蛋白表達(dá)水平。同時(shí)對(duì)p21、Ki-67、TP53進(jìn)行基因測(cè)序。操作者共有兩位，均有豐富的臨床工作經(jīng)驗(yàn)，并且對(duì)本次研究不知情，為單盲法判斷。

2 結(jié)果

2.1 3組57例Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤標(biāo)本TP53、p21、Ki-67蛋白質(zhì)分子表達(dá)水平對(duì)比 復(fù)發(fā)進(jìn)展組的TP53蛋白質(zhì)分子表達(dá)水平明顯高于未復(fù)發(fā)組、復(fù)發(fā)無(wú)進(jìn)展組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。復(fù)發(fā)無(wú)進(jìn)展組TP53蛋白質(zhì)分子水平明顯高于未復(fù)發(fā)組，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。復(fù)發(fā)進(jìn)展組p21、Ki-67與未復(fù)發(fā)組、復(fù)發(fā)無(wú)進(jìn)展組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

組別例數(shù)p21Ki-67TP53未復(fù)發(fā)組200.313±0.1470.354±0.1220.415±0.162?△復(fù)發(fā)進(jìn)展組190.342±0.1430.302±0.1260.702±0.131&復(fù)發(fā)無(wú)進(jìn)展組180.331±0.1450.321±0.1230.635±0.126?

*與復(fù)發(fā)進(jìn)展組比較P<0.05；△與復(fù)發(fā)無(wú)進(jìn)展組比較P<0.05

2.2 57例Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤標(biāo)本TP53、p21、Ki-67染色強(qiáng)度評(píng)分比較 復(fù)發(fā)進(jìn)展組、復(fù)發(fā)無(wú)進(jìn)展組TP53染色強(qiáng)度評(píng)分明顯高于未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。復(fù)發(fā)進(jìn)展組TP53染色強(qiáng)度評(píng)分最高，其余p21、Ki-67各組間對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2、圖1。

表2 3組TP53、p21、Ki-67染色強(qiáng)度評(píng)分比較 分

*與復(fù)發(fā)無(wú)進(jìn)展組比較P<0.05；△與復(fù)發(fā)進(jìn)展組比較P<0.05

A：Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤(HE); B：復(fù)發(fā)后p21(免疫組化)；C：復(fù)發(fā)前TP53(免疫組化)；D：復(fù)發(fā)后TP53(IHC)

2.3 TP53基因測(cè)序情況 在5例組織中發(fā)現(xiàn)6個(gè)(共4類(lèi))突變，包括外顯子5、7、8三個(gè)外顯子(各1例病變)，另外1例同時(shí)存在2個(gè)突變。所有突變者都是惡性進(jìn)展組病例。在臨床基因序列測(cè)定中有較小的概率可發(fā)現(xiàn)TP53基因突變而TP53未表達(dá)的情況。

3 討論

TP53是Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)惡性變的國(guó)內(nèi)外重點(diǎn)研究課題，其是一種被臨床較早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞生長(zhǎng)周期負(fù)調(diào)節(jié)因子[5-6]。TP53的核心作用具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、介導(dǎo)損傷后細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)以及避免細(xì)胞癌變復(fù)發(fā)惡性變的作用，在避免基因組遺傳穩(wěn)定性受影響發(fā)揮了重要的保護(hù)作用，此外TP53在決定細(xì)胞是否啟動(dòng)DNA合成有著不可或缺的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)TP53基因在免疫組化意義上過(guò)表達(dá)，結(jié)合現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外前瞻性研究分析其過(guò)表達(dá)意義，這可能是由于TP53基因突變，其介導(dǎo)的TP53蛋白半衰期較之正常TP53明顯延長(zhǎng)，繼而導(dǎo)致TP53蛋白半衰期蓄積、免疫組織化學(xué)過(guò)表達(dá)[7-8]。臨床上針對(duì)膠質(zhì)瘤與TP53基因相關(guān)性的研究探討較少，本次研究基于國(guó)外關(guān)于TP53基因的研究進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，論證了膠質(zhì)瘤與TP53基因的相關(guān)性。

本次研究結(jié)果表明復(fù)發(fā)進(jìn)展組、復(fù)發(fā)無(wú)進(jìn)展組TP53染色強(qiáng)度評(píng)分明顯高于未復(fù)發(fā)組， 復(fù)發(fā)進(jìn)展組TP53染色強(qiáng)度評(píng)分最高，其余p21、Ki-67各組間對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這是因?yàn)門(mén)P53蛋白抗體不能準(zhǔn)確識(shí)別野生型TP53與突變型TP53，Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)惡性變過(guò)程中TP53基因突變、TP53蛋白過(guò)表達(dá)多為同時(shí)發(fā)生，在此過(guò)程中突變型TP53喪失了維持基因組穩(wěn)定性以及降低基因突變率等作用[9]。常方圓等[10]在研究中針對(duì)惡性外周神經(jīng)鞘膜瘤組織標(biāo)本63例進(jìn)行樣本基因組異常情況檢測(cè)，結(jié)果表明63例惡性外周神經(jīng)鞘膜瘤組織樣本中TP53的高表達(dá)率分別為30.2%(19/63)，此研究結(jié)果提示TP53基因突變后功能失活使其監(jiān)視細(xì)胞分裂、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及減慢細(xì)胞分裂等作用均發(fā)生了變化，TP53的高表達(dá)率在惡性外周神經(jīng)鞘膜瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。結(jié)合上述研究結(jié)果分析TP53在Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)瘤中的作用：在正常狀況下TP53野生型可起到抑制Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)惡性變的作用，并通過(guò)監(jiān)視作用DNA受到損傷或發(fā)生變異時(shí)促使其自我修復(fù)，而在缺乏TP53野生型的表達(dá)情況下，DNA損傷修復(fù)不能終止在G1期，其是Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)惡性變的重要基礎(chǔ)之一，這也是復(fù)發(fā)進(jìn)展組TP53染色強(qiáng)度評(píng)分最高的原因[11-12]。

本次研究結(jié)果表明在5例組織中發(fā)現(xiàn)6個(gè)(共4類(lèi))突變，包括外顯子5、7、8三個(gè)外顯子(各1例病變)，另外1例同時(shí)存在2個(gè)突變，這提示所有突變者都是惡性進(jìn)展組病例TP53在自身結(jié)構(gòu)上具有一定特點(diǎn)，如第5、7、8三個(gè)外顯子的復(fù)等位基因呈現(xiàn)多態(tài)性，野生型TP53在5、7、8三個(gè)外顯子發(fā)生突變后轉(zhuǎn)化為突變型TP53基因，其是Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)惡性變的重要分子特點(diǎn)之一。并且突變型TP53基因的種類(lèi)較多，具有癌基因的作用，喪失了負(fù)調(diào)節(jié)作用等，突變型TP53基因后可促進(jìn)Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化以及惡性病變[13-14]。Fan等[15]在研究中表明Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)展過(guò)程中TP53發(fā)生等位基因丟失，蛋白過(guò)度表達(dá)等情況，意味著突變型TP53癌基因與Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的復(fù)發(fā)與進(jìn)展有著密切關(guān)聯(lián)，這與本次研究結(jié)果較為一致。近年來(lái)臨床針對(duì)TP53基因的研究較多，如董雯等[16]在研究中針對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化過(guò)程中的信號(hào)通路進(jìn)行分析，小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)譜芯片檢查結(jié)果提示p53信號(hào)通路在腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化過(guò)程中具有重要作用，與本次研究認(rèn)為p53信號(hào)通路介導(dǎo)Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤病變的觀點(diǎn)一致。此外目前臨床研究已經(jīng)證實(shí)TP53基因突變與人乳頭瘤病毒感染有著明顯關(guān)聯(lián)，對(duì)促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展有著重要作用，研究結(jié)果提示腫瘤抑制基因p53基因外顯子突變后會(huì)喪失原有的抑癌作用，其是TP53基因突變后參與Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤病變的有力佐證[17]。此外諸多臨床研究表明NF-κB及ERK1/2酶介導(dǎo)的p53等編碼基因在腫瘤發(fā)生與發(fā)展時(shí)起到了重要作用，腫瘤細(xì)胞增殖也主要是通過(guò)p53信號(hào)通路來(lái)完成，當(dāng)p53尚未突變時(shí)其可阻止腫瘤細(xì)胞G0期進(jìn)展至G1期，而隨著p53基因突變，其喪失了監(jiān)控腫瘤細(xì)胞增殖的作用，因此在腫瘤細(xì)胞G1期時(shí)外周血內(nèi)p53陽(yáng)性率明顯上升，其提示Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤進(jìn)展及復(fù)發(fā)與p53陽(yáng)性率上升有著密不可分的關(guān)聯(lián)[18-19]。

有待進(jìn)一步研究的問(wèn)題：Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)惡性變的分子特點(diǎn)對(duì)指導(dǎo)臨床開(kāi)展靶向治療有積極意義，TP53基因突變的研究有待進(jìn)一步深入[20]。由于本研究未采用大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探索，未能深入探究Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)惡性變的分子特點(diǎn)與Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)性，使得本次研究結(jié)果有一定局限性，突變型TP53基因促進(jìn)Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)惡性變的分子特點(diǎn)包括TP53基因突變、蛋白質(zhì)分子過(guò)表達(dá)，TP53基因突變對(duì)提示Ⅱ級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)與進(jìn)展具有重要的預(yù)示作用，值得臨床重點(diǎn)關(guān)注。