周益萍， 張健， 徐峰， 徐建峰， 朱成楚△

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院 1重癥監(jiān)護(hù)室， 2心胸外科(浙江臺(tái)州 317000)

目前全球范圍內(nèi)，食管癌是最具致命性的腫瘤之一，預(yù)后不佳，病死率高[1-2]，居腫瘤相關(guān)性死亡第6位，最常見癌癥第8位，且每年發(fā)生率呈遞增趨勢(shì)。食管癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，其中飲酒與吸煙是其危險(xiǎn)因素，過多攝入鹽漬和腌制食品也會(huì)增加食管癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[3]。我國(guó)的食管癌患者中，食管鱗癌占了大約90%。早期食管癌的臨床癥狀不明顯，往往容易被患者忽視，此外，食管拉網(wǎng)細(xì)胞學(xué)檢查、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)、超聲內(nèi)窺鏡等檢查技術(shù)對(duì)于早期食管癌缺乏有效診斷，所以大多數(shù)患者被初次診斷為食管癌時(shí)，病情極有可能處于晚期階段。較早期診斷且經(jīng)過規(guī)范治療的食管癌患者80%～90%的5年生存率[4]，晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者低于15%[5]。因此，尋找能普查篩選或輔助診斷食管癌的生物標(biāo)志物顯得尤為重要。RhoA為Rho家族GTP酶的成員，在各種生物過程扮演了重要角色，尤其是在腫瘤的癌變和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[6-7]，有研究表明降低RhoA的表達(dá)從而使得人類肺癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力顯著減弱[8]。有相關(guān)報(bào)道人類惡性腫瘤諸如肺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌中存在RhoA的過表達(dá)[9]，mRNA水平表達(dá)的有肝細(xì)胞癌與睪丸癌[6]，越來越多的證據(jù)證明，RhoA mRNA和RhoA蛋白的表達(dá)與癌癥的進(jìn)展有密切關(guān)系[10]。本項(xiàng)目研究了食管癌患者外周血中RhoA mRNA的表達(dá)水平，并與健康人群相比較，探索RhoA作為食管癌腫瘤生物標(biāo)志物的潛能。

1 資料與方法

1.1 患者與標(biāo)本 采集2016年4月至2017年10月病理確診為食管癌患者的血液標(biāo)本41例，且患者基本生命體征包括體溫、血壓、血糖等都是在正常指標(biāo)范圍，未患有除食管癌外的其他炎癥、慢性疾病、腫瘤等病患。所有患者均行胸腹腔鏡下食管癌根治術(shù)，圍術(shù)期無死亡。對(duì)照組為恩澤醫(yī)療集團(tuán)體檢中心隨機(jī)選取與食管癌組患者年齡構(gòu)成、性別占比相仿的健康人40例為對(duì)照組，各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)和生命體征都在正常范圍內(nèi)，并且他們無與食管相關(guān)的病變。研究中所有樣本的取得都是經(jīng)過患者的知情同意與醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。兩組一般情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

1.2 RNA的提取與qRT-PCR 根據(jù)TRIzol試劑(Ambion，美國(guó))制造商的使用說明書進(jìn)行全血標(biāo)本總RNA的提取。簡(jiǎn)述之，將100 μL的血液標(biāo)本與1 000 μL的TRIzol混分混合，再使用氯仿、異丙醇、乙醇等試劑進(jìn)行總RNA的提取和沉淀，然后將沉淀用DEPC水重懸。使用分光光度計(jì)(Bio-Rad，美國(guó))測(cè)定RNA的濃度和純度。放置提取的RNA于-80℃冰箱存放備用。

cDNA制備：使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo，美國(guó))根據(jù)制造商的使用說明書進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20 μL，置于T100TMThermal Cycler (Bio-Rad，美國(guó))儀器上進(jìn)行反應(yīng)。整個(gè)過程如下：RNA 1 μg，Oligo(dt) 1 μL，剩余用Water將體系調(diào)成12 μL，置于儀器中65℃，5～10 min。完畢后將其置于冰上，2 min內(nèi)加入5×Reaction Buffer 4 μL，RiboLock RNase Inhibitor 1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，RevertAid M-MuL V RT 1 μL，混勻后離心，將總的20 μL的體系置于儀器中42℃孵育60 min，70℃ 5 min，終止反應(yīng)。最后將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA放于-80℃保存?zhèn)溆?。見?。

表1 兩組的一般情況對(duì)比 例

表2 用于RhoA、GAPDH RT-PCR引物對(duì)的相關(guān)信息

RT-PCR:逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng); GAPDH:甘油醛3-磷酸脫氫酶

RT-PCR：每孔反應(yīng)體系構(gòu)成，SYBR Green Mister(Rox) 2×(conc)10 μL，F(xiàn)orward Primer(10 mmol/L) 0.25 μL，Reverse Primer(10 mmol/L) 0.25 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.5 μL，共20 μL體系。整個(gè)反應(yīng)過程在7300 Real-Time PCR System(ABI，美國(guó))儀器上進(jìn)行。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

為便于數(shù)據(jù)分析，RhoA mRNA在外周血中的表達(dá)水平通過GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。每個(gè)測(cè)定設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。使用2-ΔΔCt法比較食管癌組與對(duì)照組、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移食管癌患者與對(duì)照組外周血中RhoA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組外周血中的RhoA mRNA的表達(dá)水平高于對(duì)照組 通過對(duì)qRT-PCR結(jié)果的分析來比較食管癌患者與對(duì)照組人群外周血RhoA表達(dá)水平的差異。食管癌組與對(duì)照組中均有RhoA mRNA的表達(dá)，且數(shù)據(jù)經(jīng)過GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化后顯示食管癌組RhoA mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(0.963±0.671vs0.393±0.127，P<0.05)。見圖1。利用Younden指數(shù)的ROC曲線得到能區(qū)分食管癌患者與對(duì)照組人群的截?cái)嘀?。RhoA mRNA在敏感度為70.73%、特異度為100.00%時(shí)，最佳截?cái)嘀禐?.707，此時(shí)AUC為0.911(95%置信區(qū)間，0.810～0.969)。見圖2。

圖1 RhoA在食管癌患者及對(duì)照組人群外周血中的表達(dá)水平

圖2 RhoA檢測(cè)食管癌的ROC曲線

2.2 淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移食管癌患者外周血中的RhoA mRNA的表達(dá)水平高于對(duì)照組 我們對(duì)淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的食管癌患者與對(duì)照組做了分析比較。標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)提示淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的食管癌患者外周血中RhoA mRNA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(0.778±0.066vs0.393±0.127，P<0.05)。見圖3。敏感度為78.57%，特異度為95%時(shí)，最佳截?cái)嘀禐?.734，這時(shí)AUC為0.900(95%置信區(qū)間，0.784～0.976)。見圖4。

2.3 食管癌患者外周血中RhoA的表達(dá)水平與生命基本特征或腫瘤基本特征的關(guān)系 外周血中RhoA的表達(dá)水平與患者的年齡(P=0.098)、性別(P=0.546)、腫瘤部位(P=0.168)無顯著關(guān)系。食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與未轉(zhuǎn)移患者RhoA表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.773)。見表3、圖5。

圖3 RhoA在食管癌淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者及對(duì)照組人群外周血中的表達(dá)水平

圖4 RhoA檢測(cè)食管癌淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的ROC曲線

臨床病理特征例數(shù)全血中RhoA mRNA的表達(dá)P值性別0.546 男261.012±0.743 女150.878±0.537年齡0.104 ≤61歲150.738±0.305 >61歲261.093±0.788腫瘤部位0.168 中或者中上201.112±0.782 下或者中下210.821±0.526腫瘤類型0.507 鱗癌351.005±0.716 腺癌40.761±0.208 其他2/淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.773 是210.927±0.701 否141.014±0.770 未知6/

A:食管癌患者外周血RhoA表達(dá)水平與性別無相關(guān)性(P=0.546)。B:食管癌患者外周血RhoA表達(dá)水平與年齡無相關(guān)性(P=0.104)。C:食管癌患者外周血RhoA表達(dá)水平與腫瘤部位同樣無相關(guān)性(P=0.168)

圖5外周血中的RhoA的表達(dá)與食管癌患者性別、年齡和腫瘤部位無顯著關(guān)系

3 討論

食管癌患者無論局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其預(yù)后通常較差[11]。因此，普查篩選出食管癌患者尤其早期患者并進(jìn)行有效的治療對(duì)于其預(yù)后格外關(guān)鍵[12]。為了明確食管癌外周血中RhoA mRNA的表達(dá)是否可作為食管癌檢測(cè)的潛在生物標(biāo)志物，我們對(duì)41例食管癌患者與40例健康志愿者外周血RhoA mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。我們發(fā)現(xiàn)，食管癌患者外周血中RhoA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組的水平，并且與患者年齡、性別、腫瘤部位無相關(guān)性，其與腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系需進(jìn)一步的研究，這表明血液中的RhoA mRNA可作為食管癌普查篩選的潛在生物標(biāo)志物，亦可作為輔助診斷食管癌的工具。

根據(jù)近些年的報(bào)道，食管癌患者中，癌組織中RhoA的表達(dá)水平較正常的食管組織有明顯的升高[13-14]。本研究中，外周血中的RhoA mRNA的表達(dá)水平顯著高于年齡、性別構(gòu)成比相仿的健康人群，從ROC曲線結(jié)果分析，RhoA的最佳截?cái)嘀禐?.707，其敏感度為70.73%，特異度為100.00%，AUC為0.911，這些結(jié)果提示外周血RhoA能有效地鑒別食管癌患者與健康人群。

除此之外，我們進(jìn)一步將食管癌淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者與對(duì)照組進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者外周血RhoA表達(dá)水平顯著高于后者，最佳截?cái)嘀禐?.734，其敏感度為78.57%，特異度為95.00%，AUC為0.900，這揭示了外周血中的RhoA mRNA對(duì)食管癌淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者能高敏感度檢測(cè)到，普查篩選較早期的食管癌患者，對(duì)于其預(yù)后可能是重要的生物標(biāo)志物[15-16]。

根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)外周血中RhoA的表達(dá)程度與患者的年齡，性別和腫瘤部位無相關(guān)性[17]，遺憾的是，我們的數(shù)據(jù)沒能發(fā)現(xiàn)食管癌淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者與轉(zhuǎn)移患者RhoA的表達(dá)的差異，這可能與本研究樣本量不夠大有關(guān)。RhoA與腫瘤分化之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

盡管肝細(xì)胞癌、膀胱癌、乳腺癌與一些顱內(nèi)腫瘤中都有RhoA的表達(dá)[18]，食管癌患者外周血中的RhoA的表達(dá)也并非絕對(duì)特異性，但血液中RhoA mRNA的表達(dá)水平對(duì)普查篩選食管癌患者尤其可能的早期患者，這對(duì)于及時(shí)診治改善預(yù)后和提高患者生存時(shí)間依然具有重要的指標(biāo)作用[19],或許與其他生物標(biāo)志物相一起進(jìn)行預(yù)測(cè)更合理[15,20]。

總而言之，我們通過研究發(fā)現(xiàn)食管癌患者外周血中RhoA mRNA表達(dá)水平較健康人群高，且敏感性與特異性好，因此有可能作為食管癌的潛在生物標(biāo)志物。經(jīng)過進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)食管癌淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的患者與對(duì)照組人群相比，RhoA mRNA高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示其具有作為篩選食管癌的參考指標(biāo)的潛能。