施肖堃 郭仲杰 蔡志欣 盧園萍 陳美元廖劍華

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，特色食用菌繁育與栽培國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州 350014）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）是我國的大宗食用菌之一，近年全國雙孢蘑菇年產(chǎn)量達(dá)200萬噸以上，占世界年產(chǎn)量的一半左右，產(chǎn)值達(dá)200多億元人民幣[1]。近幾十年來歐美等發(fā)達(dá)國家的雙孢蘑菇生產(chǎn)都采用工廠化模式，配套以產(chǎn)量高、周期短的工廠化生產(chǎn)專用高產(chǎn)類型品種，產(chǎn)品多為鮮銷[2]。而我國數(shù)十年來都以農(nóng)業(yè)方式生產(chǎn)為主，至今農(nóng)業(yè)方式生產(chǎn)量約占總量的80%。產(chǎn)品除鮮銷外，部分加工成罐頭外銷。所用的品種以優(yōu)質(zhì)為主、兼顧高產(chǎn)，如本單位選育的As2796、W192系列品種[3,4]。

目前我國雙孢蘑菇品種創(chuàng)新改良主要采取傳統(tǒng)菌株間雜交和野生種質(zhì)與傳統(tǒng)或商業(yè)菌株間雜交。傳統(tǒng)菌株指未經(jīng)雜交的早期栽培菌株，主要有優(yōu)質(zhì)和高產(chǎn)兩大類型，少數(shù)為中間類型。在栽培中優(yōu)質(zhì)類型菌株的優(yōu)質(zhì)特征明顯，其出菇較遲、產(chǎn)量較低、菌蓋圓整光滑、菌柄粗短、組織致密、菌褶細(xì)小色淡、不易褐變、制罐收縮率低。而高產(chǎn)類型品種則表現(xiàn)為出菇早、產(chǎn)量高且集中、菌蓋較平有鱗片、菌柄較長、菌褶大顏色較深、組織較松、制罐收縮率高。王澤生等根據(jù)雙孢蘑菇的栽培農(nóng)藝特性，結(jié)合酯酶同工酶電泳分析，把雙孢蘑菇菌株的酯酶同工酶電泳表型區(qū)分為高產(chǎn)型（H型）、優(yōu)質(zhì)型（G型）、中間型（HG1-2型）、同核不育型（S型）和雜交型（HG4-5型）等[5,6]，其中傳統(tǒng)菌株以H型和G型為主，少量為HG1-2型。通過高產(chǎn)型（H型）和優(yōu)質(zhì)型（G型）傳統(tǒng)菌株之間的雜交，不斷獲得兼具優(yōu)質(zhì)和高產(chǎn)性狀的雙孢蘑菇新品種，對(duì)于我國雙孢蘑菇主栽品種的更新?lián)Q代至關(guān)重要。

在雙孢蘑菇育種技術(shù)上，國內(nèi)外目前都以雜交育種為主，國內(nèi)以福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所的同工酶結(jié)合DNA分子標(biāo)記輔助雜交育種為主導(dǎo)技術(shù)。上世紀(jì)90年代以后國內(nèi)外多家單位采取DNA分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，在親緣關(guān)系分析、雜交親本選擇、同核體鑒定等方面都得到一定的應(yīng)用[7～10]。但在關(guān)鍵農(nóng)藝性狀如產(chǎn)量、質(zhì)量、抗病、抗逆等方面的分析卻鮮有成功的報(bào)道。

ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間）是一種基于微衛(wèi)星序列發(fā)展起來的DNA分子標(biāo)記技術(shù)[11]。它利用人工設(shè)計(jì)合成的核苷酸重復(fù)序列引物對(duì)SSR（Simple Sequence Repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)）之間的DNA序列進(jìn)行半隨機(jī)PCR擴(kuò)增，以獲得豐富的多態(tài)性。其已被應(yīng)用于食用菌的遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、基因定位、種質(zhì)鑒定、遺傳變異分析等方面[8,10,12～14]。本研究利用ISSR技術(shù)對(duì)雙孢蘑菇不同類型的傳統(tǒng)菌株進(jìn)行擴(kuò)增，以期找到可以早期鑒別菌株優(yōu)質(zhì)或高產(chǎn)特性的DNA標(biāo)記，輔助雜交育種。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）菌株。雙孢蘑菇48個(gè)傳統(tǒng)非雜交栽培菌株（24個(gè)優(yōu)質(zhì)類型，24個(gè)高產(chǎn)類型）收集自世界各地，包括來自歐洲、美國的菌株，以及由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所保藏的國內(nèi)保留、分離的早期引進(jìn)或改良的栽培品種。其優(yōu)質(zhì)或高產(chǎn)類型已經(jīng)過栽培評(píng)價(jià)和同工酶鑒定驗(yàn)證（表1）。

（2）引物。用于本研究的19條ISSR引物序列同參考文獻(xiàn)[15]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并由陳美元等在雙孢蘑菇分析中篩選獲得[8]。其中ISSR807、ISSR834、ISSR835、ISSR841序列分別為：5'-AG5'-AGAGAGAGAGAG AGAGT，AGAGAGAGAGAGAGYT，5'-AGAGAG AGAGAGAGAGYC，5'-GAGAGAGAGAGAG AGAYC（Y=C或T）。

表1 供試菌株編號(hào)及酯酶同工酶表型

1.2 方法

（1）菌株的培養(yǎng)。將供試菌株從試管接入液體PDB培養(yǎng)基中，恒溫24℃、轉(zhuǎn)速220 r/min振蕩培養(yǎng)2～3周。PDB培養(yǎng)基配制：200 g去皮馬鈴薯的煮出液，加20 g葡萄糖，用水定容至1 000 mL，pH自然。

（2）基因組DNA提取與檢測(cè)。使用OMEGA公司Fungus Genomic DNA Extraction Kit試劑盒，操作按說明書進(jìn)行。提取的基因組DNA用Nanodrop微量核酸檢測(cè)儀檢測(cè)其濃度和雜質(zhì)污染程度，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳（電壓5 V/cm）檢測(cè)其帶型及降解程度。

（3）ISSR-PCR。擴(kuò)增體系、擴(kuò)增條件及電泳檢測(cè)均同前[8]。

2 結(jié)果與分析

通過對(duì)雙孢蘑菇具有代表性的24個(gè)優(yōu)質(zhì)類型和24個(gè)高產(chǎn)類型傳統(tǒng)菌株的ISSR-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)部分ISSR引物可以產(chǎn)生較為穩(wěn)定的帶型。其中有的引物如ISSR841可以在菌株間產(chǎn)生較好的多態(tài)性（圖1），這些引物可用于指紋圖譜分析，形成菌株間的遺傳相似性聚類圖，可判斷菌株間的親緣關(guān)系。而引物ISSR834、ISSR835、ISSR807擴(kuò)增產(chǎn)物在優(yōu)質(zhì)菌株之間或高產(chǎn)菌株之間帶型均較為一致，不產(chǎn)生明顯的多態(tài)性，但在優(yōu)質(zhì)和高產(chǎn)這兩大類型菌株之間的帶型卻不一致，產(chǎn)生了一條或數(shù)條可以區(qū)分優(yōu)質(zhì)傳統(tǒng)菌株和高產(chǎn)傳統(tǒng)菌株的標(biāo)記條帶。

圖1 引物ISSR841對(duì)雙孢蘑菇48個(gè)不同類型菌株的ISSR擴(kuò)增圖譜

圖2 引物ISSR834對(duì)雙孢蘑菇48個(gè)不同類型菌株的ISSR擴(kuò)增圖譜

圖3 引物ISSR835對(duì)雙孢蘑菇48個(gè)不同類型菌株的ISSR擴(kuò)增圖譜

引物ISSR834在優(yōu)質(zhì)類型菌株中擴(kuò)增出3 000 bp、2 900 bp、600 bp的標(biāo)記條帶，在高產(chǎn)類型菌株中擴(kuò)增出3 500 bp特征條帶（圖2）；引物ISSR835在高產(chǎn)菌株中擴(kuò)增出750 bp的特征條帶，而其他條帶在優(yōu)質(zhì)和高產(chǎn)類型菌株中同時(shí)存在（圖3）；引物ISSR807在優(yōu)質(zhì)菌株中擴(kuò)增出680 bp特征條帶，而在高產(chǎn)類型菌株中擴(kuò)增出1 000 bp特征條帶（圖4）。以上這些特異性標(biāo)記條帶分別命名為ISSR834G3000、ISSR834G2900、ISSR834G600、ISSR834H3500、ISSR835H750、ISSR807G680、ISSR807H1000，它們分別產(chǎn)生于優(yōu)質(zhì)類型或高產(chǎn)類型傳統(tǒng)菌株，與雙孢蘑菇傳統(tǒng)菌株的優(yōu)質(zhì)或高產(chǎn)性狀緊密連鎖。經(jīng)過驗(yàn)證，這些標(biāo)記條帶在傳統(tǒng)菌株中表現(xiàn)穩(wěn)定，單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用這些標(biāo)記條帶可以非常方便地區(qū)分和鑒定雙孢蘑菇傳統(tǒng)菌株的優(yōu)質(zhì)或高產(chǎn)性狀。

圖4 引物ISSR807對(duì)雙孢蘑菇48個(gè)不同類型菌株的ISSR擴(kuò)增圖譜

3 結(jié)論與討論

我們通過大規(guī)模的ISSR引物篩選和大量的菌株驗(yàn)證，找到了3個(gè)適用于雙孢蘑菇傳統(tǒng)菌株優(yōu)質(zhì)或高產(chǎn)性狀鑒定與預(yù)測(cè)的ISSR引物標(biāo)記與方法。這些引物產(chǎn)生的7條特異性標(biāo)記條帶與雙孢蘑菇的優(yōu)質(zhì)或高產(chǎn)性狀緊密連鎖，單獨(dú)或聯(lián)合利用擴(kuò)增圖譜中的這些標(biāo)記條帶便可在雙孢蘑菇雜交育種中快速地鑒定傳統(tǒng)菌株的優(yōu)質(zhì)或高產(chǎn)性狀，從而明確該傳統(tǒng)菌株是否為品種改良的重要親本來源，這對(duì)雙孢蘑菇定向雜交育種中親本類型的判別與選擇，提高育種效率具有重要的意義。

本單位多年來收集、保藏了近500份來自不同國家和地區(qū)的雙孢蘑菇栽培或野生菌株，其中有210多株為傳統(tǒng)栽培菌株[8]。通過本研究開發(fā)的ISSR標(biāo)記，結(jié)合之前的栽培評(píng)價(jià)和同工酶鑒定等手段，這些傳統(tǒng)菌株的類型及親緣關(guān)系已經(jīng)基本明確，并已應(yīng)用于常規(guī)的雜交育種中。在國際上，荷蘭、美國、法國等較早開展雙孢蘑菇栽培與育種的國家仍保藏有大量的傳統(tǒng)菌株，本單位通過與這些國家相關(guān)研究機(jī)構(gòu)的合作交流，不斷獲得一些新的傳統(tǒng)菌株。而本研究開發(fā)的ISSR特異標(biāo)記條帶可用于第一時(shí)間鑒定新獲得的菌株類型，并與其他方式的評(píng)價(jià)結(jié)果相互驗(yàn)證，保證入庫的新菌株獲得準(zhǔn)確的類型記錄，方便日后雜交育種中的親本選擇。

此外，這些與優(yōu)質(zhì)或高產(chǎn)性狀緊密連鎖的標(biāo)記條帶代表了哪些基因，以及這些基因與產(chǎn)、質(zhì)量的相關(guān)性如何，也是值得進(jìn)一步研究的課題。