王利霞，李素顏

（1.安陽市人民醫(yī)院檢驗科；2.安陽市人民醫(yī)院血液腫瘤科，河南 安陽 455000）

急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）是起源于骨髓造血干細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性克隆性疾病，其發(fā)病率、復(fù)發(fā)率和死亡率均高[1]。ALL的治療手段有化療、免疫靶向治療和骨髓移植等。盡管這些治療手段有一定的療效,但復(fù)發(fā)仍然是ALL治療的主要障礙之一[2-3]。因此,尋找ALL新的治療靶點(diǎn)，研究其發(fā)病機(jī)制,對提高ALL患者的治療效果起著極其重要的作用。miRNA-326作為microRNA分子家族中的一員,在急性白血病中的作用逐漸受到人們的關(guān)注。本文通過實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測miRNA-326在兒童ALL中的相對表達(dá)量,使用單鏈構(gòu)象多態(tài)性 PCR（Single strand conformation polymorphism PCR，PCR-SSCP）檢測N-ras基因在治療1年后的微小殘留?。╩inimal residual disease，MRD）中的變化,以期為兒童ALL的診療及監(jiān)測復(fù)發(fā)提供分子學(xué)標(biāo)志。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象 選取2016年2月-2017年2月在我院血液科就診的兒童ALL患者35例,其中男20 例,女 15 例,中位年齡 6 歲（0.5～13 歲），均為初治患者,無其他惡性腫瘤史,未接受過抗腫瘤治療。診療及分型標(biāo)準(zhǔn)參照French-America-British(FAB)、World Health Organization(WHO)和《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第三版)。同時選取非白血病兒童35例作為對照組，其中男19例，女16例，中位年齡7歲（1～12歲）。兩組患者在年齡、性別、基礎(chǔ)疾病等方面差別無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.1.2 兒童ALL臨床化療方案 將所有初治ALL患兒根據(jù)有無危險因素分為標(biāo)危組、中危組及高危組，依據(jù)CCLG-2008方案分5個階段進(jìn)行化療治療：誘導(dǎo)緩解治療（使用VDLD2方案：強(qiáng)的松、長春新堿，柔紅霉素，左旋門冬酰胺酶，地塞米松），早期強(qiáng)化治療（使用CAM方案：CTX，阿糖胞苷，6-巰基嘌呤），鞏固治療（使用HD-MTX+6-MP方案：HD-MTX+6-巰基嘌呤），延遲強(qiáng)化治療（使用 a：VDLD3—b：CAM 方案，a：長春新堿，阿霉素，左旋門冬酰胺酶，地塞米松，b：CTX，阿糖胞苷，6-巰基嘌呤），維持治療（6-MP+MTX/VD+IT方案：6-巰基嘌呤，CTX/地塞米松，長春新堿）。

1.1.3 微小殘留病檢測 治療1年后,取患者骨髓進(jìn)行檢測是否有微小殘留病 （MRD）,若患者檢出MRD,則認(rèn)為化療效果差和對化療藥物耐藥。對MRD患者進(jìn)行PCR-SSCP,以分析N-ras基因的表達(dá)。

1.2 主要儀器與試劑 人淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll分離液）購于天津灝洋生物有限公司；Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司；DNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PC R、RT-PCR試劑盒及MiRNA-326試劑盒均購于美國ABI公司；引物由上海生工公司合成。低溫高速離心機(jī)購于長沙湘儀儀器公司，小型超速離心機(jī)及移液器購于德國eppendorf公司,real-time PCR檢測儀7500、購于美國ABI公司,minicycler PCR擴(kuò)增儀購自美國Perkin Elmer公司。

1.3 RT-PCR方法檢測miRNA-326

1.3.1 骨髓單個核細(xì)胞的分離 抽取患者骨髓2～5ml，采用肝素進(jìn)行抗凝處理。使用人淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll分離液）進(jìn)行骨髓單個核細(xì)胞的分離。

1.3.2 總RNA的提取及純度、濃度檢測 將1.3.1中的骨髓單個核細(xì)胞，根據(jù)Trizol試劑盒的說明書進(jìn)行總RNA的提取,紫外線分光光度計A260/A 280比值下測量OD值計算總RNA純度及濃度的檢測。

1.3.3 加尾法抽提mi-RNA及RT-PCR檢測 、使用Poly(A)Tailing Kit試劑盒按說明書進(jìn)行5’末端加尾。、cDNA合成：使用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit試劑盒按照說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成 cDNA：100mm dNTPs 0.15 μl，Multi-ScribeTM Reverse Transcriptase 1.0 μl，10 ×RT Buffer 1.5 μl，RNase Inhibitor 0.19 μl，Nuclease free water 4.16 μl，5×RT primer 3 μl，total RNA 5 μl。整個過程于冰上完成，逆轉(zhuǎn)錄的條件為：16℃30 min;42℃30 min;85℃5 min。RT-PCR反應(yīng)：20μl反應(yīng)體系如下：TaqMan MicrRNA Assay（20×）1μl，product from RT reaction 1.33 μl，TaqMan 2×Universal Master Mix 10 μl,Nuclease-free water 7.67μl。循環(huán)條件為：95℃變性 15s，60℃條件下退火或延伸1min，進(jìn)行40個循環(huán)。反應(yīng)中以U6作為內(nèi)參基因，miRNA-326引物順序見表1。所有試驗在不同時間點(diǎn)進(jìn)行至少3次重復(fù),計算各組2-△△Ct值。

表1 miRNA-326、5s及U6 snRNA引物序列

1.4.1 DNA的提取 取MRD患者（MRD+）骨髓2～5ml，按照酚-氯仿法提取DNA，經(jīng)Ficoll分離液裂解，蛋白酶K進(jìn)行消化，氯仿、酚和異戊醇等有機(jī)物進(jìn)行抽提,無水乙醇進(jìn)行沉淀。提取后的DNA用電泳鑒定，若為完整的基因組DNA則置于-80℃?zhèn)溆?。試驗對照組為ALL患兒中無MRD者（MRD-）。

1.4.2 PCR擴(kuò)增將1.4.1中提取的DNA樣本作為模板，使用minicycler PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。所用N-ras基因引物為：上游5’-GACTGAGTACAAACT GGTGG-3’,下游 5’-CTCTATGGTGGGATCATATT-3’。 整個反應(yīng)體系為 50μl，10×buffer 5μl,上下游Primer 各 1.5μl，4×dNTP 1μl，DNA 1μl。擴(kuò)增反應(yīng)條件為97℃變性10s,加Taq酶 2U，94℃變性60s,55℃退火50s,72℃延伸60s,共進(jìn)行30個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳經(jīng)溴乙錠染色后檢測。

1.4.3 SSCP分析PCR產(chǎn)物 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8μl，變性液（95%甲酰胺+0.05%溴酚藍(lán)+20mmol/L EDTA）8μl，100℃沸水中變性10min,取出后即刻置于冰水中驟冷15min，進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳,160v電壓下電泳6-8h。結(jié)束電泳后，使用2%硝酸銀進(jìn)行染色30min,再加入2.5%Na2CO3和0.1%甲醛的混合液,當(dāng)出現(xiàn)清晰電泳帶后加入10%醋酸溶液進(jìn)行固定，置凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS 17.0軟件，所測試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兒童ALL組和對照組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-326在兒童ALL中的表達(dá) 研究結(jié)果顯示，兒童ALL組miRNA-326相對表達(dá)量明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,見表2。

表2 兒童ALL組和對照組miRNA-326的相對表達(dá)水平

2.2 MRD患者N-ras基因突變分析 35例兒童ALL患者中，發(fā)生MRD者為9例（10/35,25.57%）。9例MRD患者進(jìn)行PCR-SSCP分析，SSCP的電泳結(jié)果顯示：對照組MRD-者N-ras基因PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物呈一條整齊的條帶，未見明顯基因突變。而試驗組9例MRD+者中有4例N-ras基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過SSCP電泳出現(xiàn)泳動速度比對照組快的異常條帶。這表明4例MRD+患者發(fā)生N-ras基因突變，突變發(fā)生率為44.44%。

3 討論

ALL是最常見的兒童惡性腫瘤,其發(fā)生機(jī)制涉及癌基因的激活以及抑癌基因的失活,是引起白血病細(xì)胞發(fā)生突變的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[4-5]。

miRNAs為非編碼RNAs,其生物學(xué)功能在各種疾病的發(fā)生中均發(fā)揮著作用,通過與靶基因的mRNA作用，使得靶基因的mRNA發(fā)生降解，涉及的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜多樣[6-7]。目前，miRNA在急性白血病中的研究逐漸受到人們的關(guān)注,包括miRNA-150、miRNA-335、miRNA-93 等[8-10]，而 miRNA-326在急性白血病中的研究尚少。miRNA-326是miRNAs家族成員之一，通過對靶基因的調(diào)控從而導(dǎo)致上游基因轉(zhuǎn)錄水平的異常表達(dá),引起造血系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)的紊亂,最終引起白血病或者腫瘤的發(fā)生[11-12]。

本研究通過RT-PCR檢測miRNA-326在兒童ALL中的相對表達(dá)量,結(jié)果顯示兒童ALL組miRNA-326相對表達(dá)量（2.22±0.72）明顯低于對照組（6.35±1.23），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 這表明miRNA-326在兒童ALL的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著非常重要的抑癌作用,結(jié)果與Ghodousi ES等[13]的研究結(jié)果一致。

PCR-SSCP是一種檢測基因突變的經(jīng)典方法[14]。本研究通過PCR-SSCP技術(shù)檢測兒童ALL患者發(fā)生微小殘留?。∕RD）者中的N-ras基因突變,結(jié)果顯示MRD+組較MRD-組的電泳速度快，有電泳位置和條帶含量的改變。這驗證了劉紅等[15]人的研究結(jié)果，表明在ALL患者體內(nèi)存在N-ras基因，故檢測MRD者N-ras基因的突變情況，有助于診斷白血病的復(fù)發(fā)。

綜上所述，miRNA-326在兒童ALL中的相對表達(dá)量明顯下降，N-ras基因在微小殘留病中存在突變,故miRNA-326和N-ras基因的檢測可作為兒童ALL診斷及復(fù)發(fā)的生物學(xué)標(biāo)志,也可為白血病的耐藥性監(jiān)測和治療提供新的靶點(diǎn)。