李雯 ，賴(lài)啟南 ，張志成 *，李煒 ，陳勇平 ，肖影群

（1.南昌市第九醫(yī)院，江西 南昌 330002；2.寧都縣人民醫(yī)院，江西 寧都 342800；3.宜黃縣人民醫(yī)院，江西 宜黃 344400）

全球估計(jì)有2.4億人感染乙型肝炎病毒，這些感染者患肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前我國(guó)有慢性HBV感染者約9300萬(wàn)人，慢性HBV感染可引起慢性乙型肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌[2]，我國(guó)肝硬化和HCC患者中，分別有60%和80%的比例是由HBV感染引起的[3]。因此，HBV感染已成為我國(guó)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，長(zhǎng)期威脅著我國(guó)人民的健康，同時(shí)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

目前，臨床上應(yīng)用于抗HBV治療的主要藥物是核苷（酸）類(lèi)似物（nucleoside analogues，NAs），我國(guó)主要使用的抗HBV治療的NAs為拉米夫定（LAM）、阿德福韋酯（ADV）、替比夫定（LdT）、恩替卡韋（ETV）與替諾福韋酯（TDF）。NAs因抗病毒作用強(qiáng)、口服方便、不良反應(yīng)小、價(jià)格相對(duì)易接受等優(yōu)點(diǎn)在臨床上應(yīng)用廣泛[4]，但是NAs的治療缺點(diǎn)是停藥難，需長(zhǎng)期用藥,隨著NAs的廣泛和長(zhǎng)期應(yīng)用,在治療的過(guò)程中患者很容易發(fā)生HBV耐藥突變[5]。因此,及時(shí)了解患者的耐藥情況,可以更好的指導(dǎo)臨床用藥,幫助患者制定最佳的抗病毒治療方案。

本文通過(guò)回顧性分析江西地區(qū)542例慢性乙肝患者的HBV基因分型和耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變的情況，為臨床制定抗病毒治療方案提供參考依據(jù)，幫助降低疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2017年7月-2019年6月在我院進(jìn)行HBV耐藥檢測(cè)和基因分析的542例慢性乙肝患者，其中男459例，女83例；年齡23～78歲，中位數(shù)年齡51歲。所有患者診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)2015年修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》標(biāo)準(zhǔn)[4]，并且均排除有HIV，HAV，HCV，HDV共同感染以及免疫功能不全者。

1.2 儀器與試劑 病毒核酸提取純化試劑盒，乙型肝炎病毒分型及耐藥突變基因檢測(cè)試劑盒，PCR擴(kuò)增儀（ABI 7500），PCR分子恒溫雜交儀（深圳亞能 YN-H16）。

1.3 方法

1.3.1 HBV DNA的提取 收集患者空腹靜脈血5 ml，常溫放置30 min，離心后取血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?.5ml離心管中先后加入HBV DNA提取液I和樣品（待檢血清或陰/陽(yáng)質(zhì)控品）各200uμl，振蕩混勻，13000r/min離心 5min， 棄上清,加入 50μl HBV DNA提取液II，混合均勻至沉淀完全溶解，低速離心數(shù)秒后，100℃干浴或沸水浴 10min；2000r/min離心數(shù)秒，加入5μl三氯甲烷，振蕩混勻，13000r/min離心5min；取上清3μl作為PCR反應(yīng)模板。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 取出PCR反應(yīng)管稍事離心，并在管蓋上做好標(biāo)記,加入3μl已提取的待測(cè)樣本DNA，陰性質(zhì)控及陽(yáng)性質(zhì)控同樣處理。反應(yīng)程序：50℃ 2min；95℃10min；94℃ 60s，68℃ 90s，30 個(gè)循環(huán) ；94℃ 30s，54℃30s，72℃ 30s，30 個(gè) 循 環(huán) ；72℃5min。

1.3.3 雜交 取15ml離心管，放入HBV基因分型及耐藥突變檢測(cè)膜條，然后加入5ml左右的A液，再加入25μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，100℃沸水浴中加熱10min，取出離心管，放入雜交箱47℃雜交90min。

1.3.4 洗膜和顯色 將雜交好的膜條轉(zhuǎn)移至裝有40ml B液（47℃預(yù)先預(yù)熱好）的50ml離心管中輕搖15min。然后取出膜條放入孵育液（按A液/POD=2000/1的比例配置），室溫輕搖孵育30min。棄孵育液，用A液室溫?fù)u洗2~3次，每次 5min。再用C液室溫洗膜2min。再將膜條浸泡于顯色液(10張膜體系：19mlC 液+1mlTMB+2μl30%H2O2)中避光顯色10-15min，并用純水終止顯色反應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn),以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；計(jì)數(shù)資料以n(%)表示。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)果判讀 乙型肝炎病毒患者的血清經(jīng)過(guò)HBV DNA的提取，PCR擴(kuò)增以及與膜條的雜交、顯色等過(guò)程后,可通過(guò)膜條各陣列的顯色情況(藍(lán)色斑點(diǎn))直接判讀HBV的耐藥情況及其基因型,見(jiàn)圖1。當(dāng)膜條各陣列只有CC位點(diǎn)顯色而其他位點(diǎn)不顯色，則表明被檢樣本中的HBV病毒量低于本試劑的最低檢測(cè)下限或者樣本中不存在HBV。

2.2 HBV基因分型 經(jīng)分型鑒定顯示，542例CHB中共檢出B、C、BC、BD及其他型等五種基因型,主要基因型為B型和C型,其中B基因型比例最大(83.0%，450/542),C 基因型次之(12.6%，68/542)。 此外,542例樣本中共檢測(cè)到耐藥突變184例，耐藥檢出率為33.9%(184/542),并且耐藥突變中以B、C 2種基因型為主體,其中B基因型151例,耐藥檢出率為33.6%（151/450），C基因型22例,耐藥檢出率為 32.4%（22/68），B、C基因型在耐藥檢出率方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。具體情況見(jiàn)表1。

圖1 HBV耐藥測(cè)定及基因分型膜條示意圖

表1 HBV基因分型結(jié)果

2.3 NAs藥物的耐藥情況 542例樣本中共檢測(cè)到耐藥突變184例，耐藥檢出率為33.9%（184/542）；其中，出現(xiàn)突變的184例樣本中LAM耐藥例數(shù)為152（82.6%），LdT 耐藥例數(shù)為 151（82.1%）,ADV 耐藥例數(shù)為 50（27.2%），ETV耐藥例數(shù)為 27（14.6%）,并且有 152（82.6%）例出現(xiàn)了多種藥物耐藥的情況。見(jiàn)表2。

2.4 HBV耐藥突變位點(diǎn)分析 在184例發(fā)生耐藥突變的樣本中，共發(fā)現(xiàn)了20種不同的耐藥突變模式，其中發(fā)生單個(gè)位點(diǎn)突變111例（60.3%），發(fā)生多個(gè)位點(diǎn)突變73例（39.7%）；單個(gè)位點(diǎn)以 rt204 I/V位點(diǎn)的突變檢出率最高（33.7%，62/184），多個(gè)位點(diǎn)以rt204 I/V+rt180 M的突變檢出率最高（22.3%，41/184）。見(jiàn)表3。對(duì)總的突變檢出率進(jìn)行分析顯示,突變檢出率最高的位點(diǎn)為 rt204 I/V（70.7%,130/184）,其次為 rt180 M（34.8%,64/184）,再次為 rt236 T（19.6%，36/184）。 見(jiàn)表 4。

表2 HBV耐藥株分布情況[n(%)]

3 討論

隨著核苷酸類(lèi)抗病毒藥物的普及和用藥時(shí)間延長(zhǎng)，HBV耐藥株帶來(lái)的問(wèn)題已經(jīng)嚴(yán)重?fù)p害了CHB的健康,因此及時(shí)高效的檢測(cè)出患者在治療過(guò)程中是否出現(xiàn)了耐藥顯得尤為重要。檢測(cè)乙肝耐藥突變的方法有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法、多溫度單鏈構(gòu)象多態(tài)性法、直接測(cè)序法和克隆測(cè)序法、線性探針?lè)治龇?、基因芯片技術(shù)和核酸質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)等,其中基因芯片技術(shù)和Sanger測(cè)序法是目前運(yùn)用最為廣泛的兩種技術(shù)[6]。

表3 HBV耐藥位點(diǎn)分布情況[n(%)]

表4 HBV耐藥位點(diǎn)分布情況[n(%)]

本研究采用PCR-反向點(diǎn)雜交基因芯片技術(shù)對(duì)來(lái)自江西地區(qū)542例CHB的基因型及其耐藥突變情況進(jìn)行檢測(cè)?；蚍中偷慕Y(jié)果顯示江西地區(qū)HBV 分型主要以 B（83.0%）、C（12.6%）基因型為主，檢測(cè)結(jié)果符合南方以B基因?yàn)橹鞯慕Y(jié)論，并且與本地區(qū)其他研究結(jié)果相吻合[7，8]；其中，B基因型的耐藥檢出率為33.6%（151/450）,C基因型的耐藥檢出率為 32.4%（22/68）；但是，B、C 基因型在耐藥檢出率方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，本研究還檢測(cè)到BC混合型13例，BD混合型8例以及其他型3例,同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)混合型發(fā)生耐藥的概率明顯高于其他基因型,但是因?yàn)榛旌闲突蛐偷臉颖玖勘容^少,所以混合基因型是否與耐藥突變存在關(guān)系還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量證實(shí)。

目前，臨床上用于抗乙型肝炎病毒的NAs主要是拉米夫定、替比夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋和替諾福韋酯等幾種藥物，CHB患者在使用替諾福韋酯抗病毒治療時(shí)病毒學(xué)應(yīng)答率良好，8年隨訪研究暫未發(fā)現(xiàn)TDF相關(guān)耐藥[9]。故而，本研究主要是針對(duì)前4中NAs藥物進(jìn)行突變位點(diǎn)的檢測(cè)，檢測(cè)的拉米夫定突變位點(diǎn)為rt204 I/V+rt180 M、rt204 I/V、rt181 V/T和rt207 I,替比夫定突變位點(diǎn)為rt20 4 I/V+rt180 M、rt204 I和 rt181 V/T，阿德福韋酯突變位點(diǎn)為rt181 V/T和rt236 I，恩替卡韋突變位點(diǎn)為rt204 I/V+rt180 M或rt204 I/V加rt184 I/S/A/F/L、rt250 I/L/V、rt202 G/I任意位點(diǎn)。

本文結(jié)果顯示542例樣本中有184例發(fā)生了不同程度的耐藥位點(diǎn)突變,突變檢出率為33.9%，該結(jié)果與滕菁等[10]（161/433，37.2%）和郭耿龍等[11]（67/182，36.8%）的研究結(jié)果相符；但是低于馬軍等[12](1193/2765，43.15%)和韓宇等[13]（46.87%，75/160）的研究結(jié)果；此外本研究結(jié)果又顯著高于李少燕等[14]（30/255，11.8%）和許桂丹等[15]（63/869，7.25%）的結(jié)果。究其原因，可能與耐藥基因屏障、突變對(duì)病毒適應(yīng)力的影響、患者用藥的規(guī)范性和用藥史、地域不同等多種因素相關(guān)。

突變位點(diǎn)結(jié)果分析顯示，共發(fā)現(xiàn)了20種不同的耐藥突變模式，以 rt204 I/V（33.7%，62/184）單一位點(diǎn)突變和rt204 I/V+rt180 M(22.3%，41/184)聯(lián)合位點(diǎn)突變?yōu)橹?，這兩個(gè)突變均提示LAM和LdT聯(lián)合耐藥。有48（26.1%，48/184）例患者在rt236 T和rt181 V/T位點(diǎn)發(fā)生了突變,其中31例是rt236 T突變，該位點(diǎn)突變提示ADV耐藥，13例患者是rt181 V/T突變，4例是rt236 T＋rt181 V/T聯(lián)合突變，該17例患者提示發(fā)生了LAM、LdT和ADV聯(lián)合多重耐藥。ETV是高耐藥基因屏障藥物，除了預(yù)先存在的rt204 I/V+rt180 M或rt204 I/V耐藥位點(diǎn)，還需要同時(shí)出現(xiàn)rt184 I/S/A/F/L、rt250 I/L/V和rt202 G/I任意位點(diǎn)突變[1],本研究中ETV相關(guān)的rt184、rt2 50、rt202三個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變的患者為37例，其中3例患者為rt184單一位點(diǎn)突變，5例為rt250單一位點(diǎn)突變、2例為rt202單一位點(diǎn)突變,其余27（14.6%，27/184）例患者均為rt204 I/V+rt180 M或rt204 I/V突變模式的基礎(chǔ)上分別發(fā)生rt184、rt250、rt202任意位點(diǎn)的多重耐藥突變，因此，LAM耐藥的患者換用或加用 ETV治療時(shí)需定期監(jiān)測(cè)療效，以防發(fā)生聯(lián)合多重耐藥。

本研究大樣本回顧性分析江西地區(qū)慢性乙型肝炎患者HBV基因分型與耐藥突變。提示江西地區(qū)NAs耐藥檢出率相對(duì)較高，且耐藥突變模式復(fù)雜多樣，有待深入研究，對(duì)患者在抗病毒治療過(guò)程中定期進(jìn)行NAs耐藥檢測(cè)對(duì)制定用藥方案、提高抗HBV療效以及預(yù)防耐藥株的產(chǎn)生也具有重要的臨床價(jià)值。