鄭劍鋒 ，楊峻 ，李金平 ，楊小潔 ，邵文華 ，秘思思

(1.深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院，深圳大學(xué)第五附屬醫(yī)院，廣東 深圳 518102；2.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林541004)

真核生物的蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控過程在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用,而其中翻譯起始階段的調(diào)控是限速過程,在蛋白質(zhì)翻譯過程中的作用更加重要。翻譯起始過程的異常會導(dǎo)致失常的蛋白質(zhì)組，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)的種類和相對表達量的異常,該過程的異常會導(dǎo)致疾病,包括腫瘤的發(fā)生[1-3]，因此，了解真核生物翻譯起始階段的調(diào)控機理對疾病的靶向治療具有重要的指導(dǎo)意義。真核生物翻譯起始是一個多因素參與、多步驟、動態(tài)的反應(yīng)過程[4]。所有這些步驟涉及翻譯起始因子與核糖體和mRNA的相互作用，除翻譯起始因子外，Poly(A)結(jié)合蛋白相互作用蛋白1（Poly(A)binding protein interacting protein 1，PAIP1）的作用尤為特殊，PAIP1能與真核翻譯起始因子3（Eukaryotic translation initiation factor 3，eIF3）和真核翻譯起始因子 4A（Eukaryotic translation initiation factor 4A，eIF4A）相互作用，促進了mRNA環(huán)形結(jié)構(gòu)的形成，迄今為止，人類中只發(fā)現(xiàn)PAIP1參與mRNA環(huán)化銜接，因此，PAIP1是蛋白翻譯起始必須因子[5]。Sonenberg,N等研究發(fā)現(xiàn)，PAIP1可通過結(jié)合eIF4A和PABP促進蛋白質(zhì)翻譯,并提出PAIP1可能具有結(jié)合mRNA分子的功能[6],然而,該研究沒有證實PAIP1能否結(jié)合mRNA分子。為了進一步研究PAIP1的功能，尤其證實PAIP1能否結(jié)合mRNA分子，即PAIP1的RNA結(jié)合功能，本研究通過RNA結(jié)合蛋白富集測序分析（RNA Binding Protein Immunoprecipitation sequencing，RIP-Seq）PAIP1 結(jié)合 RNA 的 分子 特征并進行富集分析，探討PAIP1的新功能。

1 資料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)與質(zhì)粒構(gòu)建 設(shè)計PAIP1基因PCR擴增引物，F(xiàn)引物：agcccgggcggatccgaattcATGTCGGACGGTTTCGATC；R 引物：gtcatccttgtagtcctcgagC TGTTTTCGCTTACGCTCTG。依照Invitrogen公司的Trizol試劑操作說明書提取HeLa細胞RNA，根據(jù)Promega公司M-MLV操作說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,對PAIP1基因進行PCR擴增,用QIAGE N公司的QIAquick PCR Purification Kit純化PCR產(chǎn)物。使用Vazyme公司的ClonExpressII One Step Cloning Kit將PAIP1-Flag克隆基因連接到pIRES-hrGFP-1a載體上，構(gòu)建PAIP1過表達和空載體質(zhì)粒，將構(gòu)建好的質(zhì)粒通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染HeLa細胞,37℃培養(yǎng)48h。使用熒光顯微鏡觀察GFP熒光信號強度來判斷質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。

1.2 PAIP1蛋白質(zhì)表達檢測 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功的HeLa細胞用預(yù)冷的1X PBS漂洗3次,棄掉PBS，向細胞培養(yǎng)皿中加入預(yù)冷的細胞裂解液 （1×PBS，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS，0.5%NP40）對細胞樣本進行裂解,收集細胞裂解液，4℃，13000 g離心20min，去除細胞碎片。將5X SDS樣品緩沖液進入至細胞裂解液中,在沸水中煮沸10min,10%SDSPAGE分離復(fù)合物。用含5%脫脂乳粉的TBST緩沖液（20 mm tris緩沖鹽水和0.1%tween-20）在室溫下孵育 1h，一抗：Flag 抗體（1：2000）、GAPDH（1：2000）和HRP結(jié)合二抗孵膜，ECL發(fā)光顯影檢測相應(yīng)蛋白水平的表達情況。

1.3 免疫共沉淀 HeLa細胞在含RNA酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的預(yù)冷細胞裂解緩沖液中裂解5min， 然后劇烈振蕩，4℃，13000 g離心 20min，去除細胞碎片。用MNase酶部分降解細胞裂解液中的PAIP1-RNA復(fù)合物。之后加入A/G-DynaBeads,anti-flag抗體，或?qū)φ誌gG抗體4℃孵育過夜。分別用低鹽洗滌液、高鹽洗滌液和1X PNK緩沖液各洗滌磁珠2次。用50μl洗脫緩沖液 （50mm Tris-Cl(PH=8.0)，10mm EDTA(PH=8.0)，1%SDS）對樣品進行重懸，70℃，1400r/min離心，孵育20min。置磁珠3min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中。取40μl樣本消解蛋白質(zhì)，從PAIP1-RNA復(fù)合物中提取RNA。剩余10μl樣本用于免疫印跡 （western blotting，WB）檢測IP效率。

1.4 iRIP-seq文庫的制備及序列分析 將1.3得到PAIP1結(jié)合 RNA,用 KAPA-RNA Hyper Prep Kit試劑盒（KAPA，KK8541）制備 cDNA 文庫，在 illumina XTen平臺上對構(gòu)建的cDNA文庫進行150bp雙端高通量測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析 用TopHat 2[7]將讀段（reads）比對到參考基因組上,將唯一映射讀段用于后續(xù)分析。Piranha分析策略用于鑒定PAIP1在基因組上的結(jié)合區(qū)域[8]。根據(jù)測序深度和覆蓋度選取某一固定長度（xx nt）為單位（bin）將基因組等分，統(tǒng)計每個bin中的reads數(shù)目。模擬數(shù)據(jù)中reads的分布情況，來作為背景噪音,然后基于zero truncated negative binomial(ZTNB)來尋找reads分布顯著高于背景的位置。在此過程中每個bin都會獲得一個p-value，根據(jù)p-value進行顯著性篩選,得到真實的結(jié)合峰。Input組和IP組樣本分別進行模擬分析,去除IP組中與Input組重疊峰。通過peak關(guān)聯(lián)分析PAIP1結(jié)合的靶基因，靶基因結(jié)合基序用HOMER軟件[9]計算獲得。

1.6 功能富集分析 利用KOBAS 2.0server對基因進行KEGG聚類分析[10]，以確定峰值相關(guān)基因（靶基因）的功能類別。采用超幾何試驗和Benjamini-Hochberg-FDR控制程序確定各項的富集程度[11]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism6.0版軟件進行數(shù)據(jù)分析。定量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（）記錄，采用t檢驗，定性數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)差異意義。

2 結(jié)果

2.1 PAIP1-Flag過表達HeLa細胞系構(gòu)建 使用pIRES-hrGFP-1a載體連接PAIP1-Flag基因構(gòu)建過表達和空載體質(zhì)粒，將構(gòu)建好的質(zhì)粒通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染HeLa細胞中。通過熒光顯微鏡照射觀察GFP熒光信號強度來判斷質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，見圖1A。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功的細胞用Western blot檢測PAIP1蛋白表達量，見圖1B。

2.2 免疫共沉淀捕獲PAIP1結(jié)合的RNA 使用Flag抗體對PAIP1過表達HeLa細胞進行RIP實驗，以IgG作為陰性對照。Western blot檢測結(jié)果分析見圖2A，實驗所用的Flag抗體能特異性地免疫沉積富集PAIP1-Flag蛋白。對免疫沉淀富集的PAIP1-Flag-RNA復(fù)合物和Input樣本提取RNA，RNA分子3’端以堿基互補配的方式結(jié)合illumina接頭，反轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以鏈置換的方法連接另一端illumina接頭，再使用illumina建庫和測序兼容引物PCR擴增，擴增后的cDNA文庫使用DNA Clean磁珠純化，在illumina測序平臺上進行雙端150bp測序反應(yīng)，測序cDNA文庫片段大小,見圖 2B。

圖2 免疫共沉淀捕獲PAIP1結(jié)合的RNA

2.3 高通量測序及數(shù)據(jù)基礎(chǔ)分析 在illumina-Xten平臺中對文庫進行雙端150bp的測序，獲得2千萬左右的原始reads數(shù)據(jù),見表1A。使用TopHat 2軟件將有效測序數(shù)據(jù)比對到人的參考基因組上,見表1B。在參考基因組上具有唯一定位的非冗余數(shù)據(jù)（rmdup reads）統(tǒng)計其在基因組各個分區(qū)部分情況,見表1C。

2.4 數(shù)據(jù)高級分析 使用Piranha軟件以Input樣本為背景對PAIP1-Flag實驗樣本rmdup reads進行Peak Calling，2次實驗樣本各分別得到peak數(shù)為4096和3308。對實驗樣本特異性的peak寬度進行統(tǒng)計，80%的peak寬度在200bp左右,見圖3A。同時對基因功能區(qū)peak分布進行分析,發(fā)現(xiàn)PAIP1主要結(jié)合位點位于 3’UTR、CDS和 Introns區(qū),見圖3B。進一步對peak關(guān)聯(lián)的gene用京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析，以確定與 PAIP1 蛋白結(jié)合的RNA參與的主要生化代謝途徑、信號傳導(dǎo)途徑、分子功能、生物過程和細胞組分。分析結(jié)果顯示,見圖3C，PAIP1結(jié)合的mRNA分子主要參與了焦點粘連、剪切體、RNA轉(zhuǎn)運、蛋白多糖在癌癥中的作用、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路等功能。

表1 A原始reads數(shù)據(jù)統(tǒng)計

3 討論

RNA 結(jié)合蛋白 （RNA binding proteins，RBPs）的定義為能結(jié)合RNA的蛋白質(zhì)，與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān),包括參與RNA的可變剪接,RNA的空間折疊等,從而導(dǎo)致RNA的表達量的變化,因此,精確確定RBPs在RNA上的結(jié)合位置和結(jié)合特點至關(guān)重要[12,13]。目前研究RBP結(jié)合位點的主要方法有CLIP-seq，但是CLIP-seq也存在有缺陷，如實驗過程復(fù)雜，成功率較低，文庫豐富度不夠等。與CLIP-seq類似的方法RIP-seq，實驗步驟相對簡單，而且能獲得和CLIP-seq比較類似的實驗結(jié)果[14]。最近有研究報道，使用DO-RIP-seq技術(shù)，也可以成功地獲得RBPs的結(jié)合位點，這為RIP-seq技術(shù)分析RBPs的結(jié)合位點提供了方案和依據(jù)[15]。

表1 B有效reads數(shù)據(jù)比對統(tǒng)計

表1 C reads在基因組不同區(qū)域上的分布

圖3 結(jié)合峰相關(guān)基因聚類分析

本研究在Hela細胞中過表達PAIP1進行iRIP-seq，發(fā)現(xiàn)PAIP1具有廣泛的RNA結(jié)合活性，結(jié)合顯著富集在CDS和Intron區(qū)域,表明PAIP1可能具有調(diào)控mRNA可變剪接功能。iRIP-seq數(shù)據(jù)綜合KEGG分析表明，PAIP1結(jié)合的RNA分子主要參與了焦點粘連、剪切體、RNA轉(zhuǎn)運、蛋白多糖在癌癥中的作用、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路。本研究對于PAIP1蛋白質(zhì)的功能和在癌癥中的作用提供了基礎(chǔ)大數(shù)據(jù)和新的研究方向。

PAIP1以前被報道的功能是調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯[6,16]，我們的研究結(jié)果顯示PAIP1結(jié)合的基因和蛋白質(zhì)翻譯起始、延伸、終止相關(guān)，表明PAIP1具有新的調(diào)控功能,通過調(diào)控翻譯相關(guān)基因的表達從而進一步調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯。PAIP1作為RNA結(jié)合蛋白的功能未見報道,本研究也明確了PAIP1的新功能，即RNA結(jié)合功能，進一步證實了Sonenberg,N等的設(shè)想[6]。本研究將為PAIP1蛋白質(zhì)的功能及機制研究提供新的研究方向。

本研究通過高通量測序手段尋找PAIP1結(jié)合靶標，發(fā)現(xiàn)PAIP1結(jié)合的分子參與了腫瘤相關(guān)分子通路，但是，這些結(jié)果是通過生物信息學(xué)分析得出的，其具體功能還未得到驗證，為了進一步明確PAIP1的作用，下一步將開展功能驗證實驗從而驗證這些結(jié)果。

文章分析得出：PAIP1結(jié)合的mRNA分子主要參與了焦點粘連、剪切體、RNA轉(zhuǎn)運、蛋白多糖在癌癥中的作用、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路等功能。這些猜想是基于信息學(xué)分析結(jié)果推論得到的，需在討論中提及后續(xù)的驗證實驗，如果條件允許,請進行下一步的驗證實驗已驗證該猜想。