王 俊，史馨瑾，孫海偉，張文濤，陳鴻軍

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.南京大學環(huán)境學院，南京210023）

流感病毒屬于正黏病毒科，是一種含囊膜病毒，基因組由8個負鏈RNA片段組成，被核蛋白（NP）緊密包裹。血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）是流感病毒主要的糖蛋白，可由病毒抗體檢測出，并據(jù)此確定病毒亞型。流感病毒可以感染多種宿主，包括豬、禽和人類。在大多數(shù)情況下，人類流感病毒感染限于呼吸道。通過口腔和鼻腔的流感病毒首先被覆蓋在呼吸道上皮的粘液層阻擋，一旦病毒成功穿過粘液層，吸附并侵入呼吸道上皮細胞，病毒就可以定植、繁殖并擴散進入免疫細胞和非免疫細胞，例如巨噬細胞和樹突狀細胞。

先天性免疫系統(tǒng)對抵御流感病毒感染至關(guān)重要。不同類型的粘膜表面有特異的免疫系統(tǒng)來抵抗侵襲。被感染細胞內(nèi)存在的病毒RNA被模式識別受體（pathogen associated molecular patterns，PRRs）識別，從而導致Ⅰ型干擾素（interferons，IFNs）、促炎性因子、促炎類花生酸和趨化因子的分泌。由巨噬細胞、肺泡上皮細胞、樹突狀細胞、漿細胞樣樹突狀細胞合成的Ⅰ型干擾素刺激數(shù)百個干擾素刺激基因在鄰近細胞中的表達，從而誘導抗病毒狀態(tài)的出現(xiàn)。促炎性因子和促炎類花生酸可導致局部和全身炎癥，引起發(fā)熱和厭食，并指導對流感病毒的適應性免疫反應。感染部位產(chǎn)生的趨化因子會向氣道招募更多種類的免疫細胞，如嗜中性粒細胞、單核細胞和自然殺傷性細胞（natural killer cell，NK）。NK靶向被病毒感染的上皮細胞，介導病毒清除。單核細胞和嗜中性粒細胞被迅速招募到流感病毒感染的肺部，與肺泡內(nèi)巨噬細胞一同清除病毒感染的細胞[1,2]。

1 流感病毒感染的先天性識別

先天性免疫系統(tǒng)通過模式識別受體（PRRs）識別病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）來識別流感病毒感染。包括以下3種：①Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）：TLR3（識別感染細胞中的病毒雙鏈RNA）[3]、TLR7（識別內(nèi)含體中病毒單鏈RNA）、TLR8（識別內(nèi)含體中病毒單鏈RNA）[4]；②視黃酸誘導基因I（retinoic acid-inducible I，RIG-I），識別5'-三磷酸RNA[5]；③NOD樣受體家族成員：NOD-LRR-Pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3（NLRP3），識別感染胞質(zhì)中存在的病毒[6]。

1.1 Toll樣受體介導的流感病毒識別TLR3可識別內(nèi)含體中的雙鏈RNA（dsRNA）。由于細胞RNA解旋酶UAP56（也稱為剪接體RNA解旋酶DDX39B）的活性，流感病毒感染過程中并不產(chǎn)生dsRNA，因此，TLR3很可能識別流感病毒基因組中未知RNA結(jié)構(gòu)。人呼吸道上皮細胞持續(xù)表達TLR3，激活后可誘導感染細胞產(chǎn)生促炎性因子，同時引起細胞病變。研究表明，致死性流感病毒感染后，TLR3-/-小鼠比野生型小鼠存活時間長，肺臟內(nèi)趨化因子表達明顯下調(diào)，白細胞和CD8+T細胞浸潤明顯減少[7]。以亞致死劑量流感病毒感染TLR3-/-小鼠時，體內(nèi)可產(chǎn)生CD4+T細胞和CD8+T細胞應答，能正常產(chǎn)生抗體，表明該通路對T細胞免疫不是必需的[8]。因此，雖然TLR3能限制病毒的復制，但同時也招募了天然免疫和適應性免疫細胞，造成了宿主的損傷。在pDCs細胞中，TLR7識別進入內(nèi)含體中的流感病毒基因組單鏈RNA，無需病毒復制。TLR7通過接頭分子MYD88分別激活多種內(nèi)含體轉(zhuǎn)導通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）和干擾素調(diào)節(jié)因子7（interferon regulatory factor 7，IRF7），刺激促炎性因子和Ⅰ型干擾素分泌。同時，TLR7指導B細胞產(chǎn)生抗體對抗病毒發(fā)揮了重要作用。TLR8表達于單核細胞和巨噬細胞中，其配體也是單鏈RNA，可刺激細胞產(chǎn)生IL-12。

1.2 RIG-I識別感染細胞中復制的RNA對于已感染的細胞（通常是上皮細胞和肺泡巨噬細胞），RIG-I識別并誘導Ⅰ型干擾素產(chǎn)生是至關(guān)重要的[9]。RIG-I主要識別病毒復制后產(chǎn)生的帶有5'三磷酸修飾的病毒雙鏈RNA[5]。識別病毒RNA后，RIG-I的解旋酶結(jié)構(gòu)域與ATP結(jié)合，從促進Caspase的構(gòu)象改變，使Caspase的招募結(jié)構(gòu)域能夠與信號配體線粒體抗病毒信號蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS）結(jié)合。流感病毒主要在細胞核內(nèi)復制。迄今為止，RIG-I識別RNA準確位置尚不清楚。最近研究表明，RIG-I存在于抗病毒應激顆粒中，與病毒RNA和干擾素刺激誘導因子，例如絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白激酶R（protein kinase，PKR），共定位[10]。將抗病毒應激顆粒裂解后，RIG-I介導的IFN應答反應明顯下調(diào)。PKR是抗病毒應激顆粒產(chǎn)生所必需的，病毒蛋白NS1可以通過劫持PKR來阻斷抗病毒應激顆粒的形成。RIG-I識別通路在抗流感病毒過程中起著關(guān)鍵作用。

1.3 NLRP3炎性小體感知細胞損傷炎性小體的形成由多種刺激觸發(fā)，包括宿主細胞膜損傷、病原感染或應激。源于多聚蛋白炎性小體復合物的NLRPs由一個NLRP（或其他PRRs）、配體ASC和前Caspase 1組成。炎性小體的激活導致前Caspase 1自催化加工形成活性形式，然后分別將前IL-1β和前IL-18切割為成熟分泌性IL-1β和IL-18。NLRP3表達于單核細胞、DCs、中性粒細胞和巨噬細胞等髓系細胞中，也可在支氣管上皮細胞中表達。炎性小體需要雙重信號被激活：信號1是由TLR、IL-1受體（IL-1R）和腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）介導的編碼前IL-1β、前IL-18和NLRP3基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[11]；信號2由宿主損傷誘導產(chǎn)生，可導致Caspase 1激活和自裂解，酶解產(chǎn)生成熟IL-1β和IL-18[12]。體內(nèi)大部分信號1主要被共生菌激活，而信號2與流感病毒感染相關(guān)。信號2至少包括以下三種類型：①流感病毒的ssRNA足以激活THP1細胞釋放IL-1β[13]；②通過流感病毒編碼的基質(zhì)蛋白2（M2）離子通道在高爾基體中級聯(lián)激活NLRP3炎性小體的形成、前IL-1β和前IL-18的切割[14]；③在巨噬細胞溶酶體中，流感病毒毒力蛋白PB1-F2產(chǎn)生大分子聚集物刺激NLRP3炎性小體活化[15]。線粒體在流感病毒感染細胞NLRP3激活中起著重要作用。在巨噬細胞中，NLRP3激活需絲裂因子2參與形成炎性小體復合體，改變線粒體膜電位。在人支氣管上皮細胞中，信號1（IL-1β和NLRP3mRNA的表達）的激活需要RIG-I依賴的Ⅰ型IFN表達，再通過激活Ⅰ型IFN受體（IFNAR）激活通路。在氣道上皮細胞中，RIG-I還直接與ASC結(jié)合形成RIG-I-ASC-炎性小體復合物[16]。因此，流感病毒感染可刺激氣道上皮細胞內(nèi)NLRP3炎性小體的激活和氣道上皮細胞中RIG-I炎癥小體的激活。NLRP3炎性小體在流感病毒先天性免疫中至關(guān)重要，3對招募白細胞進入肺部必不可少。缺乏NLRP3、Caspase 1或IL-1R的小鼠均存在肺臟壞死和呼吸功能下降現(xiàn)象，且與野生型對照組相比，死亡率明顯增加[17]。

2 干擾素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs）抗流感病毒作用

對小鼠的遺傳研究表明，包括MX蛋白、IFN誘導跨膜蛋白（interferon induced transmembrane protein，IFITM）和PKR在內(nèi)的多個ISGs在限制流感病毒感染和傳播方面具有不可或缺的作用。

MX蛋白是最早發(fā)現(xiàn)的流感病毒限制因子之一。在小鼠體內(nèi)，MX1蛋白在細胞核中表達，能有效地阻止流感病毒感染，而MX2蛋白存在于胞漿中，卻無抗流感病毒活性[18]。所有近交系小鼠都缺乏MX1和MX2功能。人受到IFNs刺激后表達MXA和MXB兩種MX蛋白。MXA蛋白是胞漿蛋白，對A型流感病毒和許多其他病毒都有很強的抗病毒活性。而MXB蛋白存在于核孔復合體的胞質(zhì)面。最近研究表明，MXB能抑制人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）感染，但不能抑制A型流感病毒感染[19]。

IFITM蛋白通過阻斷病毒粘附和內(nèi)吞作用后與宿主細胞膜的融合來限制大量病毒的復制[20]。其中，IFITM3由呼吸道上皮細胞、巨噬細胞和內(nèi)皮細胞表達。IFITM3缺陷小鼠對流感病毒感染高度敏感。IFITM3缺陷小鼠與敲除整個Ifitm位點（即缺乏Ifitm1、Ifitm2、Ifitm3、Ifitm5和Ifitm6基因）的小鼠一樣容易感染流感病毒[21]，這說明IFITM3在抵抗流感病毒感染中是一個關(guān)鍵因素。

2', 5'-寡腺苷酸合酶（2', 5' oligoadenylate synthetase，OAS）家族和核糖核酸酶L（RNase L）共同作用降解細胞內(nèi)的病毒RNA。結(jié)合雙鏈RNA后，OAS催化ATP轉(zhuǎn)化成2',5'-寡腺苷酸，激活潛在RNase L的第二信使。人和小鼠有4種OAS基因，每個基因又含多個剪接異構(gòu)體。激活的RNase L降解病毒和細胞的單鏈RNA，從而抑制蛋白合成和病毒增殖。RNase L敲除小鼠對RNA病毒包括流感病毒的易感性明顯增強[22]。

PKR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，磷酸化真核細胞翻譯起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，EIF2α）的α亞基。PKR結(jié)合病毒dsRNA，抑制翻譯，從而減少細胞和病毒蛋白合成，有效抑制病毒復制。此外，PKR還通過激活NF-κB抑制因子（IκB）在信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮作用。感染細胞中PKR的激活引起細胞凋亡、生長停止和自噬，抑制病毒復制和在宿主間的擴散。同時PKR還可以穩(wěn)定IFN-α和IFN-β的mRNA，從而確保IFN蛋白的大量合成。PKR基因敲除小鼠對各種病毒包括流感病毒的易感性明顯增加[23]。鑒于流感病毒感染并不產(chǎn)生dsRNA，因此推測在病毒感染期間，可能是RNA基因組末端之間形成的柄狀二級結(jié)構(gòu)刺激了PKR。

除了上述ISGs以外，還有其他ISGs也能夠阻斷流感病毒感染（表1）。例如：過表達單羧酸轉(zhuǎn)運體1a（SLC16A1）、FAM46A、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶D2（PRKD2）、Mx1、Irf1、Ifitm2和Ifitm3等均可有效抑制流感病毒增殖。其中SLC16A1、FAM46A和PRKD2抑制病毒復制的機制尚不清楚。編碼Viperin的基因（又稱RSAD2）過表達，通過干擾病毒出芽過程中脂筏的形成，來阻斷流感病毒釋放?？共《綢SG膽固醇25-羥化酶（Ch25H）是在IFN信號作用下表達的，通過阻斷病毒融合而將膽固醇轉(zhuǎn)化為可溶性25-羥基膽固醇（25-HC），廣譜抑制有囊膜的病毒。TRIM22則是通過抑制病毒基因組組裝發(fā)揮限制作用。ISG15是一種泛素樣蛋白，可靶向新翻譯的病毒蛋白，缺乏ISG15的小鼠對流感病毒和其他病毒更易感。

表1 目前已知的干擾素刺激基因[12,24]Table1 Interferon-stimulated genes (ISGs) that control influenza virus infection

3 免疫損傷和免疫耐受

宿主抗感染保護作用可通過增加宿主對感染源的抵抗力，或通過增加宿主對感染源的耐受性來實現(xiàn)。保護性先天免疫應答通過增強抗病毒活性和/或增加耐受性來緩解疾病，而致病性先天性免疫應答為了減少病原體數(shù)量，不惜對組織造成免疫損傷，對宿主健康會產(chǎn)生負面影響。本文將重點討論參與這兩種應答中的一些關(guān)鍵細胞因子和可溶性保護因子。

3.1 增強抵抗力的先天性免疫信號研究最深入的是通過增強抗病毒抵抗力來介導先天性免疫反應。I型IFN作為典型代表，誘導數(shù)百個ISGs作為效應物來限制病毒復制。I型IFNs還通過誘導顆粒酶B表達來增強CD8+T細胞的殺傷活性[25]。除了I型IFNs外，IFNγ（II型IFN）和IFNλ（Ⅲ型IFN家族成員）也有一定的抗病毒作用。通過IFNAR和IFNGR激活的信號通路誘導產(chǎn)生不同的ISGs。例如：MX和OAS蛋白主要由Ⅰ型IFN誘導產(chǎn)生，而不是Ⅱ型IFN。其他細胞因子也能通過招募白細胞發(fā)揮抗流感病毒作用。流感病毒感染的小鼠肺部釋放粒細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF），促進粒細胞的招募和病毒清除。GM-CSF缺陷的小鼠對低劑量流感病毒高度易感[26]。先天免疫細胞因子，如IL-1、IL-6、IL-18（除IL-12）等都能通過增強獲得性免疫應答來保護宿主。IL-1可誘導DCs從肺臟遷移至縱隔淋巴結(jié)[6]，IL-18促進CD8+T細胞產(chǎn)生IFNγ[27]，而IL-10則是在流感病毒感染的肺泡內(nèi)產(chǎn)生。

3.2 調(diào)節(jié)疾病耐受性的先天免疫反應宿主的先天性免疫保護也會增加疾病耐受性。IL-33誘導肺內(nèi)固有淋巴樣細胞（innate lymphoid cells，ILCs）分泌促進組織修復反應的表皮生長因子家族成員之一—雙向調(diào)節(jié)素（amphiregulin）[29]。ILCs通過誘導上皮修復而促進組織愈合。ILCs清除后并不影響流感病毒A/PR8/34株的病毒載量，但會導致肺臟功能受損和組織損傷增加[28]。轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是典型的免疫調(diào)節(jié)劑，幾乎所有細胞都以潛伏的非活性形式表達。流感病毒NA可將潛在的TGF-β切割成活性形式，體內(nèi)阻斷TGF-β可增加2009大流感H1N1病毒或H5N1高致病性流感毒株對小鼠的致死率[29]。將表達TGF-β的真核質(zhì)粒注入流感病毒感染的小鼠肺臟，可減少炎癥反應。TGF-β可增加疾病耐受性，但同時也降低抗病毒抵抗力。另外，CD200R也介導了抗感染損傷機制。CD200R由肺泡巨噬細胞表達，通過與肺臟上皮細胞表達的CD200相互作用，抑制巨噬細胞的炎癥反應。CD200敲除的小鼠在A/X-31（H3N2）流感病毒感染下，雖然病毒載量明顯減少，但體內(nèi)產(chǎn)生一氧化氮，炎癥細胞浸潤明顯增加[30]。

與促進宿主耐受性相反的是，其他一些因子會破壞耐受性。BALB/c小鼠肺臟的γδT細胞迅速分泌IL-17A和IL-17F來應答流感病毒A/PR8/34毒株感染[31]。與野生型小鼠相比，IL-17R敲除小鼠體重減輕，中性粒細胞減少，組織輕度損傷，但病毒載量和T細胞的激活能力不受影響[31]。TNFR1敲除小鼠在感染H5N1高致病性流感病毒后，發(fā)病率顯著降低，但病毒復制和傳播未受到任何影響[32]。由此可見，IL-17和TNF促進了炎癥反應，對疾病的耐受性喪失，對抵抗力無明顯貢獻，從而為臨床干預提供了理想的靶對象。

4 對急性肺損傷的免疫防控

流感病毒感染的致命程度取決于病毒本身毒力和先天性免疫反應。高致病性流感病毒，如1918年H1N1亞型及H5N1亞型毒株，可感染宿主呼吸道，產(chǎn)生大量促炎因子，這是由病毒毒力、病毒復制力及宿主對病毒的先天免疫反應所致。除病毒相關(guān)的分子特征外，小鼠呼吸道感染滅活的H5N1禽流感病毒或人感染H5N1流感病毒后，肺臟內(nèi)會產(chǎn)生氧化磷脂（OxPAPC）[33]。氧化磷脂刺激TLR4，導致感染小鼠急性肺臟損傷。對感染流感病毒的小鼠進行全面脂肪酶代謝分析發(fā)現(xiàn)，5-脂氧化酶代謝物在致病性流感病毒感染中占主導地位，而2,15-脂氧化酶產(chǎn)生的保護性代謝物明顯減少[34]。

目前通用的免疫治療策略，包括阿司匹林、他汀類藥物、環(huán)氧化酶抑制劑、糖皮質(zhì)激素等，均在治療流感病毒感染導致的急性肺臟損傷中無效。治療急性肺臟損傷可通過增加抗病毒抵抗力和減少由病毒或免疫系統(tǒng)介導的組織損傷。增加抵抗力的藥物必須在感染早期進行治療，且無炎癥副作用。例如：重組I型干擾素可引起“流感樣癥狀”，不能被用于治療。磷脂掃描結(jié)果鑒定出Ω-3多不飽和脂肪酸衍生的脂質(zhì)介質(zhì)調(diào)節(jié)劑保護素D1，可通過阻止RNA核輸出，從而抑制流感病毒復制。

減少炎癥反應和免疫病理損傷的手段有很多。用腺病毒載體攜帶活性TGF-β能延遲小鼠感染H5N1禽流感病毒后的死亡時間，減少病毒載量[35]。使用TGF特異性抗體可減少肺臟炎性細胞的招募和減輕損傷程度。阻礙肺臟白細胞浸潤，如導致致死性流感病毒感染相關(guān)基因特性的嗜中性粒細胞浸潤。鞘氨醇1磷酸酯受體1（sphingosine 1 phosphate receptor 1，S1PR1，也稱為S1P1）表達于淋巴細胞和內(nèi)皮細胞，可控制淋巴細胞從淋巴結(jié)滲出。S1PR1的競爭性抑制劑能在流感病毒攻毒后，短暫地阻礙趨化因子在肺臟內(nèi)皮細胞的表達，從而在不影響獲得性免疫應答和病毒載量的情況下，使小鼠免受致死性流感病毒感染。此外，試圖阻止TLR4依賴的炎癥反應可減少流感病毒感染期間產(chǎn)生的氧化磷酸脂。在小鼠模型中，用TLR4阻斷劑Eritoran（E5564）阻斷TLR4，能夠降低小鼠感染PR8病毒后的死亡率[36]。炎性小體激活的抑制劑MCC950能夠有效減少肺臟的炎性滲出，并且增加小鼠感染流感病毒后的存活率[37]。最新研究表明，NAE1抑制劑MLN4929通過抑制CRL/NF-κB信號通路和前炎性因子的表達，可以減少流行性H1N1流感病毒造成的肺臟免疫損傷[38]。

增加宿主免疫耐受性也不失為一種策略。不同類型細胞的耐受力有很大差異，而循環(huán)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)對病理損傷最易感，因此，如何保護呼吸道內(nèi)皮細胞和上皮細胞免受流感病毒感染造成的病理損傷？這是優(yōu)先要考慮的治療方向。給予能增加組織保護和修復的因子，如血管內(nèi)皮生長因子和表皮生長因子，來限制活性氧造成的損傷，已被證實對機體是有益的。重組人過氧化氫酶或乙酰香蘭酮等肺臟內(nèi)給藥，也能降低活性氧的水平，并提供保護力。