張貴剛，徐麗媛，黃海碧，韓四娥，李化生，關(guān)平原，劉國英

（金宇保靈生物藥品有限公司獸用疫苗國家工程實驗室，呼和浩特 010030）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）是一種可感染各種動物的重要病原菌，主要引發(fā)牛出血性敗血癥、牛肺炎、豬肺疫、豬萎縮性鼻炎、禽霍亂等，也能夠感染野生鳥類、海洋哺乳動物和人。Pm的致病機理相對復(fù)雜，健康動物的口腔、鼻腔和扁桃體常常存在Pm，被感染動物的呼吸道和消化道黏膜等處在發(fā)病前也已寄生了大量Pm。當(dāng)機體抵抗力下降時，病原菌首先沖破免疫防線，侵入機體并繁殖，發(fā)生外源性感染。接著Pm隨淋巴液進入血液，導(dǎo)致內(nèi)源性感染[1-3]。研究認為，Pm侵入機體感染和繁殖與菌體的莢膜有著很大的關(guān)系，它們在體內(nèi)繁殖時能夠產(chǎn)生大量內(nèi)毒素，導(dǎo)致機體發(fā)生病變[4]。Pm菌體有5個莢膜血清型，分為A、B、D、E和F型，每種莢膜血清型都可引起不同動物發(fā)病。相同莢膜血清型的不同菌株對相同宿主的毒力強弱和致病性也不同。A型和B型Pm毒力最強，感染動物的死亡率較高，發(fā)病常呈流行性。D型Pm的宿主范圍廣泛，但毒力相對較弱，多為散發(fā)性。E型菌株非常少見，F(xiàn)型菌株常見于患病火雞中[5,6]。文獻報道顯示，2008年后我國牛感染Pm的病例中，病原多為A型Pm，主要引發(fā)犢牛肺炎（又稱“運輸熱”）和牛肺炎（地方流行性肺炎）[7]。在歐美國家，死亡率較高的牛呼吸系統(tǒng)疾病多是由Pm導(dǎo)致。調(diào)查報道顯示，2014年英國牛場中多殺性巴氏桿菌病的爆發(fā)率相對較高[8]?？梢?，Pm分離株是引起牛呼吸系統(tǒng)疾病的主要原因，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損害。本研究采用常規(guī)微生物學(xué)方法和分子生物學(xué)技術(shù)，對河北省患有呼吸系統(tǒng)疾病肉牛進行病原分離培養(yǎng)和分型鑒定，為有效預(yù)防與治療提供參考，同時也為疫苗生產(chǎn)提供菌種資源。

1 材料和方法

1.1 病料與菌株在河北省某肉牛場采集病牛鼻拭子5份；多殺性巴氏桿菌A型陽性菌株由金宇保靈生物藥品有限公司國家工程實驗室病原學(xué)平臺保存。

1.2 培養(yǎng)基和主要試劑營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；馬丁肉湯培養(yǎng)基購自北京中海生物科技有限公司；胎牛血清購自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司；快速革蘭氏染液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；Phusion Hot Start II DNA Polymerase購自美國Thermo Scientific公司；Premix TaqTM、6×Loading Buffer、DL2000 Marker均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗動物昆明系小白鼠購自內(nèi)蒙古大學(xué)動物中心，體重18～22 g

1.4 病原分離培養(yǎng)將無菌采集的5份鼻拭子分別劃線接種至5%鮮血瓊脂培養(yǎng)基，同時接種到適量血清馬丁肉湯培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，觀察菌落生長特性。挑取少量可疑多殺性巴氏桿菌菌落，無菌操作涂片，進行革蘭氏染色鏡檢。將染色鑒定為可疑多殺性巴氏桿菌的HB5和HB25菌株在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基上進一步純化，記做G2代。

1.5 PCR鑒定

1.5.1 引物的設(shè)計合成 參照文獻[9]合成多殺性巴氏桿菌特異性基因kmt1，以及莢膜血清特異性基因capA、capB、capD、capE、capF序列引物，參照文獻[10]合成細菌16S rDNA序列引物，引物均由北京華大基因有限公司合成，序列信息見表1。

1.5.2 種屬PCR及分型鑒定 取HB5和HB25菌株的G2代細菌培養(yǎng)物2 mL，用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌液DNA，并采用多殺性巴氏桿菌kmt1基因通用引物進行種屬PCR擴增。反應(yīng)體系：PremixTaqTM12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5μL，DNA 模板1 μL，無酶水補至總體積25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；擴增循環(huán)30×（95℃ 60 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s）；72℃再延伸7 min， PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳。對PCR陽性的樣品分別加入5個莢膜血清特異性基因引物，進行分型鑒定，反應(yīng)體系與條件同上。

1.5.3 16SrDNA基因擴增及測序 以上述PCR鑒定為陽性Pm的DNA為模板，用高保真酶Phusion Hot Start II DNA Polymerase和16S rDNA基因序列引物進行PCR擴增。PCR體系：無酶水27.8 μL，dNTP Mix(10 mmpl/L each)0.8 μL，5× Phusion HF Buffer 8 μL，Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase (2 μ/μL)0.4 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA 模板2 μL。反應(yīng)條件： 98℃預(yù)變性30 s；擴增循環(huán)30×（98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s）；72℃延伸10 min， PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，送上海英維捷基公司測序。

1.6 致病性試驗將連續(xù)純化3代的HB25菌液進行菌落計數(shù)，并梯度稀釋至10、20、30、40 CFU。隨機分為4個攻毒組與1個對照組，每組5只小鼠。4個攻毒組小鼠分別腹腔注射10、20、30、40 CFU的HB25菌液0.1 mL，對照組小鼠均腹腔注射馬丁肉湯培養(yǎng)基0.1 mL，次日觀察小鼠發(fā)病死亡情況。

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果在5%鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，病原菌形成光滑、濕潤、圓形的水滴樣菌落，革蘭氏染色陰性，顯微鏡下呈球形或短桿狀，散在分布（圖1）。

圖1 分離菌株的形態(tài)學(xué)鑒定Fig.1 Morphological identification of isolated strain

2.2 PCR及分型鑒定結(jié)果經(jīng)分離培養(yǎng)和染色鑒定為可疑的G2代Pm菌株HB5和HB25，采用Pm種屬kmt1基因序列引物進行PCR擴增。電泳結(jié)果顯示，HB5菌株無擴增條帶，HB25菌株擴增出現(xiàn)約460 bp大小的目的條帶，鑒定為Pm（圖2）。進一步用莢膜血清特異性基因分型引物PCR鑒定HB25菌株，電泳結(jié)果顯示，條段大小約為1044 bp，說明HB25菌株為A型Pm（圖3）。

圖2 多殺性巴氏桿菌kmt1基因PCR電泳圖Fig.2 PCR result of kmt1 gene

2.3 16S rDNA基因擴增及序列分析HB25分離株經(jīng)16S rDNA基因PCR擴增，結(jié)果如圖4所示。將擴增產(chǎn)物測序后在NCBI進行BLAST比對，并對其序列進行遺傳進化分析。結(jié)果顯示，本菌株與陽性菌株SSF1-8以及GenBank中公布的8個Pm菌株16S序列相似性均在99%以上（圖5），結(jié)合患病牛臨床表現(xiàn)及分離菌培養(yǎng)特性可確定所分離菌株為牛源Pm。

圖3 HB25菌株分型鑒定結(jié)果Fig.3 Typing of strain HB25 by PCR

圖4 HB25菌株16S rDNA基因PCR結(jié)果Fig.4 PCR result of 16S rDNA of strain HB25

2.4 致病性試驗結(jié)果對4個攻毒組小鼠分別腹腔注射0.1 mL經(jīng)梯度稀釋的10、20、30、40CFU的HB25純菌液，對照組按相同方式和劑量注射馬丁肉湯培養(yǎng)基。24 h后，30 CFU組和40 CFU組小鼠均100%死亡；20 CFU攻毒組小鼠死亡4只，死亡率為80%；10 CFU組2只死亡，死亡率40%（表2）?？梢?，菌株HB25對小鼠的最小致死量為3CFU。

圖5 HB25菌株16SrDNA基因遺傳進化樹Fig.5 Phylogenetic trees of strain HB25 based on 16SrDNA gene

表2 菌株HB25的毒力檢測結(jié)果Table2 Results of virulence test of strain HB25

3 討論

Pm是呼吸道一種較為常見的條件性致病菌，當(dāng)宿主受到其他病原感染（細菌、病毒、寄生蟲等）時，抵抗力下降，或是外界環(huán)境惡劣（寒冷、潮濕、擁擠等），宿主受到應(yīng)激刺激時，都可能誘發(fā)多殺性巴氏桿菌病。近幾年，我國養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展迅速，不同地區(qū)之間的奶牛肉牛運輸尤其頻繁，加大了牛巴氏桿菌病發(fā)生和流行的概率[11]。研究發(fā)現(xiàn)，Pm的5個血清型之間在宿主嗜性、抗原特異性和致病性等方面存在較大的差異，不同血清型之間交叉保護性較低，給多殺性巴氏桿菌病的防治增加了困難。前些年，我國牛群感染的Pm以莢膜血清B型為主，但近幾年，研究者不斷從病死牛中分離到莢膜血清A型Pm，而現(xiàn)有的巴氏桿菌疫苗主要是針對莢膜血清B型，對A型Pm的保護率很低，導(dǎo)致我國牛群中A型Pm的流行與發(fā)生日益增多。目前對于牛巴氏桿菌病的綜合防治應(yīng)采取以疫苗免疫為主的預(yù)防控制措施，所以研制針對莢膜血清A型Pm的新型疫苗已迫在眉睫[13-15]。檢測結(jié)果顯示，分離的A型Pm菌株只需3 CFU即可100%致死小鼠，說明菌株毒力很強。本研究分離的菌株為高效預(yù)防該病的疫苗研制提供了基礎(chǔ)性實驗材料。