朱曉瑋，王 艷，許秀梅，楊莉莉，尹秀鳳

（南京天邦生物科技有限公司，南京 211102）

牛病毒性腹瀉是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的，臨床上以牛黏膜發(fā)炎、糜爛、壞死以及腹瀉為特征的疾病[1]。BVDV屬于黃病毒科（Flaviviridae）、瘟病毒屬（Pestivirus），與豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、綿羊邊界病毒（Border disease virus，BDV）同屬，具有抗原相關(guān)性，在血清學(xué)上存在著交叉反應(yīng)。中國BVDV流行已相當(dāng)嚴(yán)重。由于BVDV感染T細(xì)胞可引起免疫抑制，如果不采取措施對牛病毒性腹瀉進(jìn)行及時防控，一旦BVDV強(qiáng)毒株或超強(qiáng)毒株在豬群內(nèi)流行，再加上危害嚴(yán)重的豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒，將會對我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成很大影響[2]。使用BVDV污染的豬瘟疫苗免疫豬可導(dǎo)致其感染BVDV，引起類似于非典型豬瘟的發(fā)生。因此，帶有BVDV抗原的血清和牛睪丸也不能用來培養(yǎng)CSFV。

豬瘟活疫苗BVDV污染在我國時有報道，若不能及時檢測出疫苗中BVDV污染情況，會造成重大經(jīng)濟(jì)損失甚至?xí)?dǎo)致傳染病的流行。本研究參考GenBank中BVDV和豬瘟兔化弱毒病毒（Hog cholera lapinized virus，HCLV）序列設(shè)計1對引物，利用PCR對HCLV和BVDV進(jìn)行鑒別診斷，并對豬瘟生產(chǎn)所用的原輔材料、半抗原及成品進(jìn)行BVDV檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和細(xì)胞 BVDV C24V毒株（2007.12.20 F10）購自中國獸藥監(jiān)察所；HCLV C株為南京天邦生物科技有限公司生產(chǎn)用種毒；MDBK細(xì)胞購自中國獸藥監(jiān)察所；牛睪丸細(xì)胞為南京天邦生物科技有限公司自備。

1.1.2 試劑 BVDV檢測試劑盒購自中國獸藥監(jiān)察所；核酸提取試劑盒、RT-PCR反應(yīng)試劑購自TaKaRa公司。

1.1.3 樣品 2012～2017年江蘇A血清（A）、B血清公司（B）及內(nèi)蒙某血清公司（C）提供牛血清共4089份，牛睪丸152批；豬瘟各收次抗原1255份，本公司豬瘟成品苗114批。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測 PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，擴(kuò)增片段長度為312 bp。按試劑盒操作說明和RT-PCR常規(guī)方法對樣品進(jìn)行核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增及電泳檢測。

1.2.2 BVDV培養(yǎng)和鑒定 將BVDV C24V株接種至MDBK細(xì)胞單層，37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h進(jìn)行凍融收獲，作為BVDV陽性對照。將MDBK鋪96孔細(xì)胞板，長成單層后，接種RT-PCR檢測為BVDV陽性樣品和BVDV C24V株陽性對照，并設(shè)健康細(xì)胞陰性對照，37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h，按《中國獸藥典》豬瘟活疫苗外源病毒檢測和BVDV檢測試劑盒操作方法對樣品進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 BVDV繁殖結(jié)果用BVDV試劑盒對接毒細(xì)胞和健康細(xì)胞處理后，熒光顯微鏡下觀察。陽性毒株和陽性樣品接種的細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)中可以觀察到特異性綠色熒光，而健康對照細(xì)胞和樣品中含滅活的BVDV陽性樣品接種的細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)中無綠色熒光（圖1）。

圖1 BVDV細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of BVDV by cell culture

2.2 樣品RT-PCR檢測結(jié)果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，所檢BVDV 核酸陽性樣品和陽性對照在312 bp 附近出現(xiàn)特異性條帶，而所檢BVDV 核酸陰性樣品則無目的條帶（圖2）。2012～2017年BVDV RT-PCR檢測結(jié)果具體見表1和表2。

豬瘟活疫苗BVDV 污染在我國時有報道，若不能及時檢測出疫苗中BVDV污染情況，會造成重大經(jīng)濟(jì)損失，甚至?xí)?dǎo)致傳染病的流行。范學(xué)政等[3]報道豬瘟疫苗中BVDV的感染率為21.74%。2011年，葉兆美等[4]對四川省市售的豬繁殖與呼吸綜合征疫苗和豬瘟疫苗進(jìn)行了檢測，結(jié)果10份豬瘟疫苗和9份豬繁殖與呼吸綜合征疫苗中BVDV的污染率為10.53%。范仲鑫等[5]對湖南省內(nèi)的48 個批次的豬瘟疫苗進(jìn)行了BVDV檢測，陽性率為18.75%。張志等[6]對14個省的豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征弱毒招標(biāo)苗進(jìn)行檢測，有9份BVDV陽性。我國豬群中BVDV感染也相當(dāng)嚴(yán)重。吳文輝等[7]在2007年和2008年對上海市奉賢地區(qū)疑似豬瘟樣品及不同批次的豬瘟弱毒苗進(jìn)行BVDV檢測，發(fā)現(xiàn)兩者的陽性率分別為35.1%和64.1%。2009年和2010年又對該地區(qū)及鄰近區(qū)域的疑似豬瘟送檢生豬樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)BVDV陽性率分別高達(dá)80.39%和80.72%[8]。2004～2007年，戴益民等[9]報道江西省豬群中BVDV 感染率為10%～15.8%[10]。宋永峰等在2006年利用RT-PCR對浙江等6個省市的43份豬病料進(jìn)行檢測，結(jié)果檢出BVDV 陽性率達(dá)16.3%。梁晟等[11]對2010～2012年廣西省部分地區(qū)豬病進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明BVDV的檢出率為26.92%。2012 年閩西地區(qū)部分豬場的BVDV 陽性率高達(dá)94.4%，其中種豬、育肥豬、保育豬和仔豬的陽性率分別為38.5%、17.3%、2.1%和27.4%[12]。本調(diào)查結(jié)果顯示，2012～2017年共檢測4089頭新生牛血清、152批新生牛牛睪丸、1255份豬瘟抗原、114批豬瘟疫苗，BVDV陽性數(shù)分別為115、34、78和2。

圖2 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測Fig.2 Result of RT-PCR detection

表1 2012～2017年 BVDV RT-PCR檢測情況Table 1 Detection of BVDV during 2012-2017 by RT-PCR

表2 豬瘟疫苗生產(chǎn)用新生牛血清BVDV檢測情況Table 2 Detection of BVDV in newborn bovine serum for the production of CSFV vaccine

目前豬瘟細(xì)胞苗生產(chǎn)中對BVDV病原的檢測方法主要有細(xì)胞培養(yǎng)、免疫熒光染色及抑制試驗等，但這些方法在實際中很難將CSFV和BVDV進(jìn)行區(qū)分，而且耗時長，每次檢測樣本少，不利于生物制品原材料的快速檢測。PCR敏感快速，每次檢測的樣本多，可用于BVDV牛血清的篩選。豬瘟原代細(xì)胞苗在生產(chǎn)過程中要用到牛血清、牛睪丸等牛源產(chǎn)品，原材料中若帶有低滴度的BVDV，將會對豬瘟疫苗造成污染，進(jìn)而對使用該疫苗的豬造成危害，對養(yǎng)殖業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失。

本研究中所用引物經(jīng)過反復(fù)驗證，對BVDV特異且敏感，無論活毒還是死毒都可檢出。盡管死毒對疫苗的使用效果影響不大，但是本公司為了嚴(yán)格控制豬瘟疫苗質(zhì)量，只要RT-PCR檢出陽性，一律廢棄。RT-PCR檢測可用于豬瘟細(xì)胞苗全過程BVDV控制，或其他生產(chǎn)過程中用到牛血清的豬用活疫苗，如豬偽狂犬病活疫苗、豬藍(lán)耳病弱毒活疫苗等。本研究中盡管對細(xì)胞培養(yǎng)用牛血清及牛睪丸進(jìn)行了檢測篩選，但在后面的半抗原和成品檢測中仍有一定的陽性檢出。有的是血清中失去活力的BVDV造成，如某批細(xì)胞的二收BVDV檢測陽性，三收和四收BVDV檢測結(jié)果卻為陰性；有的是血清或牛睪丸中的活毒造成，如2016年的12份陽性樣品，分別為07批、15批和19批3批細(xì)胞的1～4收次收獲液。如果牛睪丸細(xì)胞中存在BVDV活毒，該批細(xì)胞則無法繁殖豬瘟病毒，用熒光定量PCR檢測不到豬瘟病毒。《中國藥典》三部（2010版）附錄也對新生牛血清檢測提出了相同的技術(shù)要求[13]。雖然各國對于牛血清的生產(chǎn)均有嚴(yán)格的技術(shù)規(guī)范，但由于檢測技術(shù)存在局限性，市場上的牛血清還是存在BVDV污染的現(xiàn)象。本研究所測牛血清樣品均為血清公司提供的經(jīng)過檢測的專門用于豬瘟病毒培養(yǎng)的血清。江蘇兩個血清公司提供的新生牛血清BVDV陽性率仍然為2.1%～4.97%，牛睪丸BVDV陽性率為30%左右，這也同時證明BVDV在江蘇省牛群中感染十分嚴(yán)重。因此，本公司2016年后從內(nèi)蒙某公司采購豬瘟專用新生牛血清和牛睪丸，保證了產(chǎn)品質(zhì)量。另外，大品牌的血清也要堅持檢測，本研究檢測2批進(jìn)口胎牛血清，結(jié)果1批BVDV陽性；檢測3批進(jìn)口小牛血清，其中2批BVDV陽性（表略）。張強(qiáng)等[14]采用RT-PCR檢測進(jìn)口胎牛血清，9份中有7份陽性。王競晗等[15]從進(jìn)口胎牛血清中成功分離到致細(xì)胞病變的BVDV FBS2014株。這些數(shù)據(jù)均說明進(jìn)口胎牛血清BVDV陽性率相當(dāng)高。

總之，為保證生物制品安全，所有原輔材料和最終產(chǎn)品都必需檢測潛在污染物。疫苗生產(chǎn)企業(yè)必須嚴(yán)格按照GMP規(guī)范組織生產(chǎn)，對疫苗生產(chǎn)全過程進(jìn)行質(zhì)量控制，重點加強(qiáng)對原輔材料質(zhì)量控制，制定嚴(yán)格的內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)真開展原輔材料入廠檢測工作[16]。